[發明專利]用于使探針與文庫快速雜交的方法和試劑盒

有效

• 申請號: 202010895989.2
• 申請日: 2020-08-31
• 公開（公告）號: CN111926066B
• 公開（公告）日: 2022-06-21
• 發明（設計）人: 韓營民;陳文浩;盧亞明
• 申請（專利權）人: 伯科生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6874
• 分類號: C12Q1/6874
• 代理公司: 北京北匯律師事務所 11711
• 代理人: 高元吉

1.一種用于非疾病診斷目的的使探針與文庫快速雜交的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(1) 使探針與文庫在雜交緩沖液中接觸，其中，使探針提前加入雜交緩沖液，而不是在文庫變性后加入雜交緩沖液，所述雜交緩沖液包括檸檬酸鈉緩沖液、2 M甜菜堿、1 M四甲基氯化銨、4-6%重量/體積比的硫酸葡聚糖、18-44體積%的甲酰胺；所述文庫與所述探針的變性溫度為92-98℃，變性時間為30秒至2分鐘；所述探針與所述文庫在雜交緩沖液中雜交結合的時間為0.5小時；

(2) 在探針與文庫結合形成復合體后，利用經磁珠清洗緩沖液清洗并活化的磁珠經鏈霉親和素捕獲復合體，所述磁珠清洗緩沖液組分包括3 M NaCl、10 mM Tris-HCl pH 7.5、1mM EDTA和0.1% Tween-20；且在清洗后，鏈霉親和素磁珠仍然保持在磁珠清洗緩沖液中，而無需棄掉磁珠清洗緩沖液；

(3) 利用清洗液對與鏈霉親和素結合的復合體進行清洗，所述清洗液包括：

清洗液S：1X SSC、0.1 % Tween-20；

清洗液I：1X SSC、0.1 %十二烷基磺酸鈉；

清洗液II：0.5X SSC；

清洗液III：0.2X SSC；

(4) 利用PCR反應富集與探針結合的目標文庫，然后純化，隨后進行高通量測序，富集時間為15-45分鐘。

2.根據權利要求1所述的用于非疾病診斷目的的使探針與文庫快速雜交的方法，其特征在于，所述探針為5’生物素修飾的單鏈DNA，其長度為110-130nt。

3.根據權利要求1所述的用于非疾病診斷目的的使探針與文庫快速雜交的方法，其特征在于，包括依次以下步驟：

(a) 將預文庫、接頭阻斷劑和探針混合，然后蒸干，所述預文庫包括適用于MGI測序儀、Illumina測序儀、Life測序儀的預文庫；

(b) 向步驟(a)產物中加入雜交緩沖液，混勻并在室溫孵育5分鐘，隨后95 ℃變性2分鐘，65 ℃孵育30分鐘；

(c) 雜交完成后，探針與鏈霉親和素磁珠結合15分鐘，所述鏈霉親和素磁珠經磁珠清洗緩沖液清洗兩遍，并存在于50μL 磁珠清洗緩沖液中；

(d) 在65 ℃條件下，使用65 ℃的清洗液I清洗步驟(c)的鏈霉親和素磁珠清洗一次；

(e) 在65 ℃條件下，使用65 ℃的清洗液S清洗磁珠兩次；

(f) 使用清洗液I在室溫孵育渦旋混勻2分鐘以清洗磁珠；

(g) 使用清洗液II在室溫孵育渦旋混勻1分鐘以清洗磁珠；

(h) 使用清洗液III在室溫孵育渦旋混勻0.5分鐘以清洗磁珠；

(i) PCR富集，并純化文庫；

(j) 對純化后的文庫進行高通量測序。