[發明專利]用于使探針與文庫快速雜交的方法和試劑盒

有效

• 申請號: 202010895989.2
• 申請日: 2020-08-31
• 公開（公告）號: CN111926066B
• 公開（公告）日: 2022-06-21
• 發明（設計）人: 韓營民;陳文浩;盧亞明
• 申請（專利權）人: 伯科生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6874
• 分類號: C12Q1/6874
• 代理公司: 北京北匯律師事務所 11711
• 代理人: 高元吉

本發明公開用于使探針與文庫快速雜交的方法和試劑盒。本發明通過加入化合物和雜交促進劑使得雜交時間大大縮短，在保持較高的特異性與均一性的基礎上，變性時間由傳統的10分鐘減少為30秒，雜交時間由16小時以上降低至0.5小時，探針富集時間由45分鐘縮短至20分鐘。

技術領域

本發明涉及基因測序領域，具體地涉及用于使探針與文庫快速雜交的方法和試劑盒。

背景技術

高通量測序技術兼備高通量和高準確性優勢，正在逐步改變傳統臨床診斷領域，包括遺傳病輔助診斷、腫瘤用藥伴隨診斷以及病原體檢測等方面。在高通量測序技術中，靶向測序技術是應用最廣的技術之一，具有準確，經濟等多種特點。

靶向測序技術分為三類，包括基于PCR原理的擴增子技術(Amplicon)，基于雜交原理的捕獲技術(Capture)以及基于雜交、延伸和連接原理的分子倒置探針技術(MIP)。上述方法具有各自的應用場景，Ampliocn受限于覆蓋均一性，適用于較小目標區域的靶向測序、而Capture則不受目標區域尺寸的限制，已廣泛應用于腫瘤伴隨診斷、無創單基因病診斷、病原體檢測等領域。

捕獲技術也具有一定的局限性，例如操作較為繁瑣，實驗周期較長。在捕獲的傳統實驗流程中，探針/文庫的雜交時間在16小時以上，占捕獲流程的50％以上；因此，進一步縮短變性、雜交以及探針富集時間，將從根本上提升捕獲技術的時效性，更加貼合臨床診斷的需求。

腫瘤的發生是由于一系列基因突變的積累，進而導致細胞中信號通路紊亂，細胞分裂周期出現錯誤，最終導致細胞惡性增殖。臨床需要在診療全程根據患者個體的基因突變情況進行藥物或療法的選擇，也就是伴隨診斷。基于第二代高通量測序的捕獲技術已經廣泛應用于臨床級別的腫瘤基因伴隨診斷，并獲得了相關部門的批準，但整個檢測流程時間仍然較長，因此，優化捕獲技術的雜交流程，使之在保持檢測性能的同時，能夠快速完成檢測，對于將來進一步優化腫瘤基因伴隨診斷具有現實意義。

發明內容

針對現有技術中存在的技術問題，本發明通過加入化合物和雜交促進劑在保持較高的特異性與均一性的基礎上，使得雜交時間大大縮短。具體地，本發明包括以下內容。

本發明的第一方面，提供一種用于使探針與文庫快速雜交的方法，其包括以下步驟：

(1)使探針與文庫在雜交緩沖液中接觸；

(2)在探針與文庫結合形成復合體后，利用經磁珠清洗緩沖液清洗并活化的磁珠經鏈霉親和素捕獲復合體；

(3)利用清洗液對與鏈霉親和素結合的復合體進行清洗；

(4)利用PCR反應富集與探針結合的目標文庫，然后純化，隨后進行高通量測序。

根據本發明的用于使探針與文庫快速雜交的方法，優選地，使探針提前加入雜交緩沖液，而不是在文庫變性后加入雜交緩沖液。

根據本發明的用于使探針與文庫快速雜交的方法，優選地，所述文庫與所述探針的變性溫度為92-98℃，例如93、95或97℃，變性時間為30秒至2分鐘，例如1分鐘，優選2分鐘。

根據本發明的用于使探針與文庫快速雜交的方法，優選地，所述探針為5’生物素修飾的單鏈DNA，其長度為110-130nt，優選為120nt。

根據本發明的用于使探針與文庫快速雜交的方法，優選地，所述雜交緩沖液包括檸檬酸鈉緩沖液、0.8-1.2M甜菜堿、0.8-1.2M四甲基氯化銨、4-6％重量/體積比的硫酸葡聚糖、18-44體積％的甲酰胺。優選地，此處的檸檬酸鈉緩沖液為1X，甜菜堿為1M，四甲基氯化銨為1M，硫酸葡聚糖的濃度為5％重量/體積比，甲酰胺為20體積％。

根據本發明的用于使探針與文庫快速雜交的方法，優選地，所述探針與所述文庫在雜交緩沖液中雜交結合的時間為0.5-4小時，優選為0.5小時。