[發明專利]一種分析風干臘肉蛋白質及風味的方法

在審

• 申請號: 202010895085.X
• 申請日: 2020-08-31
• 公開（公告）號: CN111929397A
• 公開（公告）日: 2020-11-13
• 發明（設計）人: 曲直;鄭善清;劉楠;李瑞玲;李博
• 申請（專利權）人: 河南大學
• 主分類號: G01N30/08
• 分類號: G01N30/08;G01N30/88
• 代理公司: 成都方圓聿聯專利代理事務所(普通合伙) 51241
• 代理人: 李鵬

1.一種分析風干臘肉脂肪酶活性及風味的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1、臘肉制備

肋條肉進行漂洗、腌制、扎繩、干燥、成品整理、包裝；

2、頂空固相微萃取條件

萃取纖維頭老化：第一次使用時，50/30μmDVB/CAR/PDMS萃取纖維頭需在氣相色譜進樣口270℃老化1h；

將臘肉均勻取樣，剪碎成小塊，稱取3.0g放入15ml樣品瓶中，用50/30μmDVB/CAR/PDMS萃取纖維頭于40℃恒溫吸附60min，進樣口250℃解吸5min，得到樣品風味物質；

3、風味物質分析

樣品風味物質采用SPME結合GC-MS分析方法，在60℃條件下萃取30min富集揮發性化合物，然后用氣相色譜來分析纖維頭上的揮發性化合物，將揮發性成分的質譜數據與MEANLIB、REPLIB、WILLEY、NISTDEMO4個圖片庫資料進行比較，相似指數800以上為確認鑒定的化合物，并對鑒定出的各物質進行峰面積歸一化定量分析；

4、肌漿蛋白的測定

提取腌制肉的肌漿蛋白，提取腌肉的肌原纖維蛋白；肌漿蛋白和肌原纖維蛋白進行氮測定；

5、測量SH和S-S組水平

SH組分別在0.5mL肌漿蛋白和肌原纖維蛋白中加入2.5mL Tris-glycine buffer、8mol/L尿素、20mol/L Ellman reagent；室溫孵育1h,8000×g離心15min，總SH組分別加入0.2mL肌漿蛋白和肌原纖維蛋白，加入2mL三甘氨酸緩沖液、10mol/L尿素、0.02mL min-巰基乙醇；室溫靜置1h，與冷的50％TCA混合至終濃度10％，3000×g離心15min，加入3mL三甘氨酸緩沖液，8mol/L尿素沉淀；

用分光光度計在412nm處測定吸光度；以牛血清白蛋白(BSA)為標準，測定蛋白含量為280nm；計算公式為:mol SH/g＝73.53×A412/C；mol總SH/g＝73.53×A412/C；mol s/g＝mol總SH/g-mol SH/g

式中，73.53為106/1.36×104,1.36×104為摩爾消光系數，C為蛋白樣品濃度，mg/mL；

6、測定羰基含量

羰基分析；將2ml肌漿蛋白和肌原纖維蛋白分別加入50％TCA至終濃度10％，8000×g離心15min，用3ml丙酮洗滌沉淀，去除殘留TCA；一種沉淀用2ml的2mol/L HCl處理，另一種沉淀用等體積的0.2％(w/v)2,4-二硝基苯肼(DNPH)在2mol/L HCl中處理，室溫下放置1h；4000×g離心10min，用2ml乙醇/乙酸乙酯(1:1)洗滌沉淀；將沉淀溶解于3ml的6mol/L鹽酸胍中，加入20mmol/L磷酸鈉緩沖液，pH 6.5；以6mol/L胍中的牛血清白蛋白為標準，在280nm的鹽酸對照條件下，計算上清液中的蛋白濃度；用分光光度計在370nm處測定吸光度；

7、蛋白質表面疏水性(H0)的測定

肌漿蛋白的表面疏水性測定：用10mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)對每個肌漿蛋白進行一系列稀釋，得到的蛋白濃度范圍為0.05-2.0mg/mL；然后將每個肌漿蛋白加入4ml，分別加入20mol-8mmol/L 1-苯胺-8-萘磺酸鹽(ANS)；使用Cray Eclipse熒光光度計在20±0.5℃下測量波長390nm(激發)和470nm(發射)的熒光強度(FI)；FI與蛋白濃度曲線的初始斜率通過線性回歸分析計算，并作為H0的指標；

肌原纖維的疏水性測定：向1mL肌原纖維懸液中加入1mg/mL溴酚藍(BPB)40mol/L混勻；在pH為6.0的條件下，向1ml 20mmol/L的磷酸鹽緩沖液中加入40個聚丙稀,1mg/mL BPB，以制備不含肌原纖維的對照；樣品和對照在室溫下攪拌10min,2000×g離心15min；在595nm處對空白磷酸鹽緩沖液測定上清液的吸光度；BPB邊界量，由下式給出，BPB邊界(指揮部)＝40指揮部L×(OD control-ODsample)/ODcontrol；

8、肌漿蛋白的圓二色性(CD)光譜分析

采用應用光物理光譜偏振儀對肌漿蛋白進行測定，獲得CD光譜；使用10mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)，蛋白濃度約為0.1mg/mL；肌漿蛋白樣品在190-260nm進行掃描；所有計算都假設氨基酸殘基的平均值為110；采用CONN CD譜反褶積軟件對數據進行壓縮，Molec軟件對數據進行反褶積；分子量(Da)為4000，氨基酸數為36；

9、統計分析

采用SPSS Statistics V17進行將上述步驟3至8所得到的數據進行統計學分析和方法比較；樣本和評審員的數據采用單因素方差分析進行分析，時間為:0h、6h、18h、36h、54h和72h，P0.05為差異顯著。

2.根據權利要求1所述的一種分析風干臘肉脂肪酶活性及風味的方法，其特征在于，步驟4具體如下：

提取腌制肉的肌漿蛋白，并對其進行了輕微的修改；取50g的腌肉，加入500mL磷酸緩沖液，溫度4℃，5000×g離心15min；上清為肌漿蛋白；

提取腌肉的肌原纖維蛋白；10g樣品加入到100ml pH為6.5的溶液中，溶液中含有50mmol/L NaCl、25mmol/L KCl、3mmol/L MgCl2、1mmol/L苯甲磺酰氟(PMSF)和4mmol/LEDTA；溫度4℃，2000×g離心15min；再懸浮于50ml0.45mol/L KCl,15.6mmol/L Na2HPO4,3.5mmol/L KH2PO4,pH 7.5中；

保留50ml的肌漿蛋白和3ml的肌原纖維蛋白進行氮測定，用sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質組分；肌質和肌纖維蛋白分別是1:1混合標準樣品緩沖含有50更易與L Tris-HCl 8mol/L尿素,2摩爾/L硫脲,5％(v/v)β巰基乙醇,2％(w/v)SDS,0.1％(v/v)溴酚藍在pH值為6.8,在100℃和加熱5分鐘,在8000×g離心5分鐘；一個整除(15μL)的上層清液應用于凝膠,間隔凝膠是5％,解決凝膠是15％；間隔凝膠和分辨凝膠的電流分別為20mA和40mA。