[發(fā)明專利]一種添加兒茶素沒食子酸酯提高變色栓菌漆酶產(chǎn)量的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010893486.1
• 申請日: 2020-08-31
• 公開（公告）號: CN111925976A
• 公開（公告）日: 2020-11-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王鋒;李湘;徐玲
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇大學
• 主分類號: C12N1/38
• 分類號: C12N1/38;C12N1/14;C12N9/02;C12R1/645
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明公開了一種添加兒茶素沒食子酸酯提高變色栓菌漆酶產(chǎn)量的方法，涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域。該方法包括：在變色栓菌漆酶發(fā)酵過程的菌絲體生長階段，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加兒茶素沒食子酸酯，并繼續(xù)發(fā)酵以產(chǎn)生漆酶。應(yīng)用該方法能夠大幅提高變色栓菌的漆酶產(chǎn)量；并且該方法操作簡單，易于放大生產(chǎn)，適于大規(guī)模漆酶發(fā)酵，從而降低漆酶生產(chǎn)成本，滿足規(guī)模化應(yīng)用的要求。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種提高變色栓菌漆酶產(chǎn)量的方法。

背景技術(shù)

漆酶(二醇∶氧氧化還原酶，EC 1.10.3.2)是一種含銅的多酚氧化酶，能氧化多種不同結(jié)構(gòu)的底物，同時將分子氧還原成水。漆酶首先在Toxicodendron vernicifluum(日本漆樹，以前稱為Rhus vernicifera)中被發(fā)現(xiàn)，而后通過大量的研究發(fā)現(xiàn)漆酶在自然界中分布于多種植物、真菌、少數(shù)細菌和昆蟲中，其中真菌漆酶是漆酶的主要來源。目前漆酶主要用于有機合成、環(huán)境污染物的降解和染料脫色、生物檢測和電化學分析、造紙工業(yè)中的紙漿漂泊和廢水處理、纖維原料的降解等，正在不斷地推進漆酶走向工業(yè)化應(yīng)用的步伐。然而，目前漆酶在工業(yè)化應(yīng)用中還存在發(fā)酵表達水平低、分離純化操作復(fù)雜、實際應(yīng)用成本高等問題，因此，提高漆酶發(fā)酵水平、降低應(yīng)用成本成為漆酶相關(guān)研究中急需解決的問題。

漆酶的生產(chǎn)主要采用兩種發(fā)酵方式：液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵。液態(tài)發(fā)酵具有傳質(zhì)好、混合均勻、易放大的優(yōu)勢，采用這種方式進行漆酶生產(chǎn)在一定程度上降低了漆酶的生產(chǎn)成本。但液態(tài)發(fā)酵獲得的漆酶的濃度較低，增加了漆酶分離純化的難度。固態(tài)發(fā)酵是微生物在沒有或基本游離水的質(zhì)上方式，利用自然底物或利用惰性底做固體支持，更符合真菌的自然生長條件。與液態(tài)發(fā)酵相比，漆酶固態(tài)發(fā)酵具有水分活度低，微生物易生長，酶活力高，酶系豐富等優(yōu)點。

變色栓菌是用于漆酶生產(chǎn)的優(yōu)良真菌菌株，其已經(jīng)有商業(yè)化漆酶產(chǎn)品在售，用途廣泛。真菌漆酶的合成可通過誘導(dǎo)劑來調(diào)控，達到增加漆酶產(chǎn)量的目的。目前已經(jīng)報道的用于漆酶誘導(dǎo)表達的誘導(dǎo)劑主要包括：芳香族化合物，如愈創(chuàng)木酚、2,5-二甲基苯胺、藜蘆醇、對羥基苯甲酸、阿魏酸、香草酸等；以Cu²⁺為代表的金屬離子；氨基酸和維生素等。酚類、木質(zhì)素或木質(zhì)素衍生物等芳香族類化合物通常被添加到真菌培養(yǎng)基中提高漆酶產(chǎn)量，激發(fā)漆酶催化聚合反應(yīng)從而發(fā)揮防御作用，減少氧自由基引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)。添加1mM愈創(chuàng)木酚作用于不同的真菌可提高漆酶2倍以上漆酶產(chǎn)量，但當培養(yǎng)基中含有高濃度(1mM)的外源性芳香族化合物時，由于無法適應(yīng)生長環(huán)境，菌絲體的生理狀態(tài)受抑制從而影響細菌生長。但是，芳香族化合物通常都具有毒性，使用其作為誘導(dǎo)劑可能會由于殘留造成環(huán)境污染。金屬對漆酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控廣泛存在于真菌中，而漆酶作為一種含銅多氧酶，銅對漆酶的誘導(dǎo)中有重要作用，Ag⁺、Mg²⁺也被稱為漆酶轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器。在400μM的Cu²⁺濃度下產(chǎn)量大幅提高，但過渡態(tài)重金屬離子的添加同樣可能會造成環(huán)境污染；額外添加氨基酸和維生素可在一定程度上增加漆酶產(chǎn)量，但效果有限，且生物素、核黃素等價格昂貴。由此可見，現(xiàn)有的漆酶誘導(dǎo)劑均存在各自的缺點和不足，探索天然無污染的高效誘導(dǎo)劑提高生產(chǎn)漆酶是研究的熱點，而從自然界中尋找天然酚類誘導(dǎo)劑是解決此問題的有效途徑之一。專利申請人通過對大量天然酚類物質(zhì)漆酶誘導(dǎo)表達效果和機制的研究發(fā)現(xiàn)，兒茶素沒食子酸酯(CG)是一種極具潛力的漆酶誘導(dǎo)物，具有誘導(dǎo)效率高、用量少、適用范圍廣的優(yōu)點。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種提高變色栓菌漆酶產(chǎn)量的方法。該方法能夠大幅提高變色栓菌的漆酶產(chǎn)量；并且該方法操作簡單，易于放大生產(chǎn)，適于大規(guī)模漆酶發(fā)酵，從而降低漆酶生產(chǎn)成本，滿足規(guī)模化應(yīng)用的要求。

為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

一種提高變色栓菌漆酶產(chǎn)量的方法，包括：在變色栓菌漆酶發(fā)酵過程的菌絲體生長階段，向發(fā)酵液中添加兒茶素沒食子酸酯，并繼續(xù)發(fā)酵以產(chǎn)生漆酶。