[發明專利]一種快速鑒定二倍體基因編輯作物T0

在審

• 申請號: 202010892955.8
• 申請日: 2020-08-31
• 公開（公告）號: CN112094933A
• 公開（公告）日: 2020-12-18
• 發明（設計）人: 閆曉紅;吳剛;趙圣博;羅君玲
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院油料作物研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 薛紅凡

本發明提供了一種快速鑒定二倍體基因編輯作物T₀代基因型的方法，涉及基因型鑒定技術領域。本發明所述方法首先根據T₀代初次Sanger測序峰圖性質，針對測序結果，結合序列比對，確定基因編輯作物的純合基因型。為了驗證對嵌合體基因型的判斷及區分雜合體或雙等位基因突變基因型，對雜峰PCR產物進行T/A克隆，進行第二次Sanger測序；將測序結果用NCBI Blast工具與野生型序列進行比對，確定基因編輯的具體序列，驗證首次Sanger測序峰圖對嵌合體基因型的判定，確定雜合體和雙等位基因突變基因型，從而實現了快速鑒定二倍體基因編輯作物T₀代所有基因型的目的。

技術領域

本發明屬于基因型鑒定技術領域，具體涉及一種快速鑒定二倍體基因編輯作物T₀代基因型的方法。

背景技術

基因組編輯技術在作物育種中得到迅猛發展，這些基因編輯序列特異性核酸酶為基礎，包括鋅指核酸酶(zinc fingernuclease,ZFN)、轉錄激活樣效應物核酸酶(transcription activator-like effectornucleases,TALENs)、RNA引導的規律成簇間隔短回文重復(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats,CRISPR)/Cas9及通過CRISPR/Cas9改進的CRISPR/Cpf系統，在基因組特定位點切割雙鏈DNA，然后通過非同源末端連接或同源重組方式修復雙鏈缺口，從而在編輯位點附近發生堿基的缺失、插入或替換,達到編輯基因的目的。

植物基因編輯技術往往借助常用的植物遺傳轉化方法，例如電穿孔、農桿菌介導的遺傳轉化等方法，對植物基因組特定位點進行插入、刪除、替換等編輯，從而快速得到特定目標性狀的品種，加快育種速度。但由于基因編輯技術和遺傳轉化方法的限制，在遺傳轉化過程中往往產生很少雙等位基因純合突變植物，大部分為雜合體、嵌合體、雙等位基因突變、陰性等基因型植株，這對快速鑒定和檢測純合編輯植株帶來了挑戰。目前鑒定基因編輯植株的方法主要為PCR/RE(restriction endonuclease)方法、錯配切割法、TaqMan方法、高分辨率溶解曲線分析方法，臨界退火溫度ACT-PCR(at critical temperature PCR)、sanger測序等，但是這些方法并不能很好鑒定出T0代的基因型。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于一種快速鑒定二倍體基因編輯作物T₀代基因型的方法，簡便快捷，可簡單獲知基因編輯作物T₀代植株的基因型。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了一種快速鑒定二倍體基因編輯作物T₀代基因型的方法，包括以下步驟：(1)以二倍體基因編輯作物T₀代的基因組DNA為模板DNA，在基因編輯靶標位點的上下游設計特異性引物，進行PCR擴增，將得到的PCR產物回收后純化和第一次Sanger測序；當測序測序結果為單一峰圖，則所述基因編輯作物T₀代的植株為純合植株(雙等位基因純合突變或純合的轉基因陰性植株)；當測序結果單一峰后面出現3個信號峰，則為嵌合體；單一峰后面出現2個信號峰，則為雜合體或雙等位基因突變基因型；

(2)對于測序結果有雜峰或套峰的所述PCR產物進行T/A克隆，得連接產物；

(3)將所述連接產物轉化感受態細胞，在LB培養基中震蕩培養60min后，將菌液涂抹在含氨芐青霉素的LB平板上，培養8～12h，挑取單菌落于含氨芐青霉素的LB培養基中震蕩培養8h后，進行第二次Sanger測序；將測序結果用NCBI Blast工具，與野生型序列進行比對；基因編輯序列為三個不同的序列，則為嵌合體；基因編輯序列為兩個不同的序列，則為雙等位基因突變基因型；對應的兩個序列，一個為野生型，一個為突變序列，則為雜合體基因型。