[發(fā)明專利]一種快速鑒定二倍體基因編輯作物T0

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010892955.8
• 申請(qǐng)日: 2020-08-31
• 公開（公告）號(hào): CN112094933A
• 公開（公告）日: 2020-12-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 閆曉紅;吳剛;趙圣博;羅君玲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 薛紅凡

1.一種快速鑒定二倍體基因編輯作物T₀代基因型的方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)以二倍體基因編輯作物T₀代的基因組DNA為模板DNA，在基因編輯靶標(biāo)位點(diǎn)的上下游設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將得到的PCR產(chǎn)物回收后純化和第一次Sanger測(cè)序；當(dāng)測(cè)序結(jié)果為單一峰圖，則所述基因編輯作物T₀代的植株為純合植株；當(dāng)測(cè)序結(jié)果單一峰后面出現(xiàn)3個(gè)信號(hào)峰，則為嵌合體；單一峰后面出現(xiàn)2個(gè)信號(hào)峰，則為雜合體或雙等位基因突變基因型；

(2)對(duì)于測(cè)序結(jié)果有雜峰或套峰的所述PCR產(chǎn)物進(jìn)行T/A克隆，得連接產(chǎn)物；

(3)將所述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，在LB培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)60min后，將菌液涂抹在含氨芐青霉素的LB平板上，培養(yǎng)8～12h，挑取單菌落于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)8h后，進(jìn)行第二次Sanger測(cè)序；將測(cè)序結(jié)果用NCBIBlast工具，與野生型序列進(jìn)行比對(duì)；基因編輯序列為三個(gè)不同的序列，則為嵌合體；基因編輯序列為兩個(gè)不同的序列，則為雙等位基因突變基因型；對(duì)應(yīng)的兩個(gè)序列，一個(gè)為野生型，一個(gè)為突變序列，則為雜合體基因型。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟(1)中在基因編輯靶標(biāo)位點(diǎn)的下游350～500bp處設(shè)計(jì)特異性引物。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，在得到所述特異性引物后，還包括利用所述特異性引物和陰性植株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條帶單一；回收和純化PCR產(chǎn)物后，進(jìn)行第一次sanger測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示無雜峰。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟(1)所述PCR擴(kuò)增的體系以20μl計(jì)，包括：模板DNA 1μl，10mM dNTPs 0.5μl，所述特異性引物的上下游引物各0.5μl，10×ExTaqBuffer2μl，Ex Taq 0.1μl，加水補(bǔ)足至20μl。

5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述方法，其特征在于，步驟(1)所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序包括：94℃預(yù)變性2min；94℃變性30s，56℃退火50s，72℃延伸40s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟(1)中測(cè)序結(jié)果僅為單一峰圖，判定所述基因編輯作物T₀代的植株為純合植株，包括雙等位基因純合突變或陰性植株后，還包括用NCBIBlast與野生型靶位點(diǎn)序列進(jìn)行比對(duì)，來判斷純合基因型，如果和野生型序列一致，則為純合陰性植株；如果不一致，則為雙等位基因純合突變。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟(2)中利用CV21-ZeroBackgroundpTOPO-TA/Blunt Cloning Kit進(jìn)行所述T/A克隆。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述方法，其特征在于，所述T/A克隆的體系以10μl計(jì)，包括：pTOPO-Blunt Simple Vector 1μl，PCR產(chǎn)物1μl，10×Enhancer 1μl和滅菌水7μl。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟(3)所述含氨芐青霉素的LB平板和含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中氨芐青霉素的濃度均為100μg/ml。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟(3)所述震蕩培養(yǎng)和培養(yǎng)的溫度均為37℃。