[發明專利]輔助診斷結直腸癌的組合物、試劑盒及其用途

有效

• 申請號: 202010892075.0
• 申請日: 2020-08-31
• 公開（公告）號: CN111748636B
• 公開（公告）日: 2020-11-17
• 發明（設計）人: 戴立忠;周镕;紀博知;劉佳
• 申請（專利權）人: 圣湘生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 北京派特恩知識產權代理有限公司 11270
• 代理人: 劉欣;張穎玲

本發明涉及分子生物學檢測領域，更具體地，涉及Septin9、NDRG4和SDC2三個基因的甲基化檢測。本發明提供了一種輔助診斷結直腸癌的組合物；同時，還提供了含該組合物的試劑盒，所述組合物的用途。使用本發明的組合物能夠以高靈敏度和特異性對早期結直腸癌進行篩查，三基因聯合檢測，減少了上樣量，也減少了操作，避免樣本被過度稀釋，其成本低，操作便捷。

技術領域

本發明涉及分子生物學檢測領域，具體地，涉及輔助診斷結直腸癌的領域，更具體地，涉及Septin9、NDRG4和SDC2三個基因的甲基化檢測。

背景技術

結直腸癌作為現行比較高發的消化道腫瘤，由于其起病的隱匿性，使得大多數人在確診時已經是中晚期，因此，結直腸癌的早期篩查對于治療結直腸癌是非常重要的。

目前在結直腸癌篩查上主要有兩種常用技術。一種是大便隱血試驗。該方法是檢測大便中的血液成分（檢測對象是血紅蛋白），若多次、持續的陽性反應提示消化道出血，應做進一步檢查以警惕腸道腫瘤的發生。該法的優點是結果顯示快、清晰，結果可以半定量。但其特異性差，抗干擾能力差缺點也很明顯，其次該方法的靈敏度差一級限制條件非常多等因素也影響了其作為結直腸癌診斷的準確判斷。另一種方法是腸鏡檢查。目前腸鏡檢查對于腸內病變診斷而言，是最有效可靠的診斷方法，也是目前其它診療手段無法替代的主要手段。然而，其也存在一系列的缺點：包括檢查前期準備工作的不友好性以及檢查過程中病人的痛苦兩方面，大大影響了該項技術的實際應用和推廣。

除了上述兩種方法之外，分子診斷方法是近年來發展迅速的癌癥診斷方法。目前，已有大量的結直腸癌分子標記物在組織和血液樣本中被研究和報道，例如：

Septin9基因是Hartwell等發現的Septin基因家族成員之一，具有鳥苷三磷酸酶（GTPase）活性。Septin9基因位于人類染色體17q25.3，含有17個外顯子，長約2.40×10⁵bp，編碼Septin 9蛋白。但由于其轉錄產物包含多個翻譯起點和變異剪接，Septin9可變異產生18種變異剪接體、編碼15種多肽。Septin9基因及其表達產物廣泛參與人體各種生理過程，如細胞極化、細胞增殖與凋亡、細 胞內外物質運輸、細胞骨架調節等。研究表明，Septin9基因在結直腸癌發生中起抑癌基因作用，其甲基化會抑制其基因正常表達，使其抑癌功能喪失，并最終導致細胞分裂和癌變。

NDRG4（N-myc downstream-regulated gene 4）為抑癌基因NDRG基因家族成員，基因長32kb，由17個外顯子和16個內含子組成。大量研究表明，NDRG4基因與腫瘤的發生、發展和轉移有關，其5’端調控區含有CpG島，在結直腸癌的發展過程中常常被甲基化，被認為是結直腸癌的重要生物學特征。因此，通過NDRG4基因啟動子區域甲基化水平的檢測為結直腸癌的無創篩查提供了有效途徑。

SDC2基因是已知的一種參與細胞分裂、遷移和在結腸間充質細胞中表達的蛋白質。據發現，腫瘤組織中SDC2目標區域的甲基化水平，顯著地更高于成對相鄰非腫瘤組織中的SDC2目標區域。通過分析133例CRC患者原發腫瘤和其成對相鄰非腫瘤組織樣本中的SDC2甲基化水平，研究人員發現，SDC2基因的轉錄調控區域中，腫瘤組織樣本顯示甲基化水平顯著地更高于對照的相鄰非腫瘤組織樣本。

目前，根據樣本的預處理方式不同，現有的DNA甲基化檢測技術主要有三大類：

1）基于限制性酶切預處理的甲基化檢測技術：這種方法是利用甲基化敏感性限制性內切酶對甲基化區域不切割的特性，將DNA消化為不同大小的片段后，再通過PCR擴增分離產物，以明確目標片段的甲基化狀態；

2）基于亞硫酸鹽修飾預處理的甲基化檢測技術：這種方法是DNA經亞硫酸鹽處理后，未甲基化的胞嘧啶（C）被轉化成尿嘧啶（U），甲基化的胞嘧啶保持不變。處理后的DNA通過測序或使用特異性引物PCR得到非常準確的DNA序列甲基化位點信息；