[發(fā)明專利]沿階草AFLP分子指紋圖譜庫(kù)的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010891862.3
• 申請(qǐng)日: 2020-08-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112080496A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-12-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 梁慧敏;李晨龍;梁棟;劉艷;白玉梅;夏陽(yáng);袁詩(shī)宇;翟云菲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C12Q1/6895
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 王艷

本發(fā)明公開(kāi)了一種引物對(duì)組合，本發(fā)明還公開(kāi)了所述引物對(duì)組合在沿階草種質(zhì)鑒別或品種鑒定或AFLP分子指紋圖譜庫(kù)的構(gòu)建中的應(yīng)用。本發(fā)明還公開(kāi)了一種沿階草AFLP分子指紋圖譜庫(kù)的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。本發(fā)明經(jīng)過(guò)反復(fù)多次不懈的試驗(yàn)成功地篩選到能有效鑒別沿階草不同種質(zhì)的選擇性擴(kuò)增引物及引物組合，高質(zhì)量的DNA指紋圖譜，不但具有擴(kuò)增位點(diǎn)多、帶型質(zhì)量好、分辨率高、條帶疏密合適及分布均勻，易精準(zhǔn)地檢測(cè)出樣本的細(xì)微差異，從而為構(gòu)建沿階草AFLP分子指紋圖譜庫(kù)奠定了技術(shù)基礎(chǔ)；還通過(guò)提供的試劑方法九對(duì)引物組合等成功而有效的鑒別出30個(gè)不同種質(zhì)沿階草，為今后沿階草種質(zhì)鑒別、新品種登記、注冊(cè)和產(chǎn)權(quán)保護(hù)等提供了科學(xué)依據(jù)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物分子育種領(lǐng)域，涉及一種沿階草AFLP分子指紋圖譜庫(kù)的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，尤其涉及到為形態(tài)上不便于鑒別的沿階草提供一種能通過(guò)分子指紋圖譜庫(kù)中的遺傳標(biāo)記進(jìn)行種質(zhì)鑒別或品種鑒定及品種權(quán)保護(hù)等方面的鑒定技術(shù)。

背景技術(shù)

沿階草又名麥冬(Ophiopogon japonicus)，屬百合科沿階草屬多年生常綠草本地被或構(gòu)景植物，也是傳統(tǒng)的道地中藥，被《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品滋陰、潤(rùn)肺清心的中藥藥材，是我國(guó)特有的一種重要的鄉(xiāng)土植物，國(guó)外日本、越南、朝鮮和印度也有分布。其野生種質(zhì)資源非常豐富，種類繁多；近年來(lái)民間開(kāi)發(fā)利用的力度也很大，由此引起的種質(zhì)混亂現(xiàn)象也十分嚴(yán)重；沿階草種質(zhì)特有的一些遺傳性狀如矮生性、強(qiáng)耐蔭性及藥理活性(如含有多糖和高異黃銅類化合物等活性物質(zhì))等基因資源的發(fā)掘及利用研究也逐漸得到學(xué)界業(yè)界重視。沿階草良好地經(jīng)濟(jì)效益，友好地環(huán)境適應(yīng)性，使其開(kāi)發(fā)利用前景廣闊。鑒于沿階草的發(fā)展前景及目前的使用狀況，亟待加強(qiáng)對(duì)其種質(zhì)的鑒別篩選，品種鑒定及品種權(quán)的保護(hù)等。

生物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中或理化誘變劑下所產(chǎn)生的可遺傳變異，都是由于DNA 堿基序列變異所致。同一物種內(nèi)存在的極為豐富的DNA堿基序列變異，為開(kāi)發(fā)和利用DNA分子標(biāo)記作為遺傳鑒定奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。一般狹義地分子標(biāo)記是指可遺傳的并可檢測(cè)的DNA序列標(biāo)記，是DNA水平上遺傳多態(tài)性的直接反映。目前，以DNA水平為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)包括PCR技術(shù)、RFLP技術(shù)、RAPD技術(shù)、AFLP 技術(shù)、SSR和ISSR技術(shù)、多位點(diǎn)小衛(wèi)星DNA指紋技術(shù)和微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)、基因芯片技術(shù)以及SNP技術(shù)等。

AFLP是一種基于RFLP和PCR基礎(chǔ)上的遺傳標(biāo)記指紋圖譜技術(shù)，它與上述其它方法相比，具有高度個(gè)體特異性和穩(wěn)定可靠性，且以快速、靈敏、檢測(cè)效率高、遺傳多態(tài)性豐富等特點(diǎn)，大大提高了遺傳分析的效率。是可以為任何來(lái)源的種質(zhì)提供有力的DNA指紋，評(píng)估遺傳多樣性，有效地確定親本之間的遺傳差異和親緣關(guān)系的一種十分先進(jìn)的分子標(biāo)記；AFLP以其檢測(cè)的位點(diǎn)數(shù)多，保證了鑒定的高度準(zhǔn)確性，因而被公認(rèn)為是植物種質(zhì)建立指紋圖譜效率最高的理想標(biāo)記。其技術(shù)既可以用于檢測(cè)品種的質(zhì)量和純度，也可運(yùn)用于稀有珍貴植物資源和名、特、優(yōu)品種的鑒定、引種以及瀕危植物的考察和保護(hù)工作。其高質(zhì)量指紋圖譜、穩(wěn)定可靠的分析結(jié)果不但有利于更好地利用大量豐富的育種種質(zhì)資源，更可作為新品種登記、注冊(cè)和產(chǎn)權(quán)保護(hù)的重要依據(jù)。但到目前為止，國(guó)內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)應(yīng)用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)沿階草種質(zhì)進(jìn)行分子檢測(cè)、鑒別等方面的報(bào)道，更未發(fā)現(xiàn)利用優(yōu)選出的9對(duì)AFLP引物組合構(gòu)建沿階草AFLP分子指紋圖譜庫(kù)方法及應(yīng)用方面的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供了沿階草AFLP分子指紋圖譜庫(kù)的構(gòu)建方法及種質(zhì)鑒別，目的在于為形態(tài)上不便于鑒別的沿階草提供一種能進(jìn)行種質(zhì)鑒別或品種鑒定及品種權(quán)保護(hù)等方面的應(yīng)用技術(shù)。本發(fā)明通過(guò)收集到的不同地域沿階草種質(zhì)及由誘變細(xì)胞再生獲得的創(chuàng)新種質(zhì)為基礎(chǔ)構(gòu)建了沿階草AFLP分子標(biāo)記指紋圖譜庫(kù)；本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于直接對(duì)沿階草基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)，不受田間環(huán)境等因素對(duì)沿階草表型的影響；另外使用該方法可在幼苗期對(duì)不同種質(zhì)(品種)進(jìn)行快速準(zhǔn)確地檢測(cè)鑒定，大大縮短了檢測(cè)周期。所以此項(xiàng)發(fā)明可應(yīng)用于沿階草不同品種或種質(zhì)的鑒定、鑒別與種質(zhì)資源的保護(hù)等，且對(duì)沿階草分子育種具有重要的現(xiàn)實(shí)意義及應(yīng)用價(jià)值。