[發明專利]沿階草AFLP分子指紋圖譜庫的構建方法及其應用

在審

• 申請號: 202010891862.3
• 申請日: 2020-08-28
• 公開（公告）號: CN112080496A
• 公開（公告）日: 2020-12-15
• 發明（設計）人: 梁慧敏;李晨龍;梁棟;劉艷;白玉梅;夏陽;袁詩宇;翟云菲
• 申請（專利權）人: 江蘇農林職業技術學院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/6895
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 王艷

1.一種引物對組合，其特征在于，所述引物對組合包括九組引物對，所述九組引物對包括引物E-AAG和引物M- CTC、引物E-AAG和引物M-CTT、引物E-AAG和引物M-CTG、引物E-ACG和引物M-CAG、引物E-ACA和引物M-CAC、引物E-ACT和引物M-CAA、引物E-ACT和引物M-CTC、引物E-ACG和引物M-CAC、引物E-ACG和引物M-CAG、引物E-ACG和引物M-CTA、引物M-CAG和引物M-CTT，所述引物E-AAG序列如SEQ ID NO：1所示，所述引物M- CTC序列如SEQ ID NO：2所示；所述引物M-CTT序列如SEQ ID NO：3所示，所述引物E-ACA序列如SEQ ID NO：4所示，所述引物M-CAC序列如SEQ ID NO：5所示，所述引物E-ACT序列如SEQ ID NO：6所示，所述引物M-CAA序列如SEQ ID NO：7所示，所述引物E-ACG序列如SEQ ID NO：8所示，所述引物M-CAG序列如SEQID NO：9所示，所述引物M-CTA序列如SEQ ID NO：10所示。

2.權利要求1所述的引物對組合在沿階草種質鑒別或品種鑒定或AFLP分子指紋圖譜庫的構建中的應用。

3.一種沿階草AFLP分子指紋圖譜庫的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）沿階草不同種質獲得：通過收集多點多地區不同種質或品種的沿階草及通過理化誘變劑誘導體細胞基因突變體胚再生獲得不同種質沿階草，將其種植成沿階草種質資源圃；

2）沿階草基因組DNA的提取：在生長季采集不同種質沿階草的新鮮幼嫩葉片分別裝袋帶回實驗室，采用CTAB法提取DNA；

3）沿階草AFLP反應體系的建立與優化：將提取的不同種質沿階草基因組DNA，經過酶切、連接、預擴增、選擇性擴增、電泳步驟，得到各個種質的相應條帶或指紋圖譜，其中具有相同條帶的被認為是擁有同樣的遺傳位點，具有不同大小的條帶被認為擁有不同的遺傳位點，由此獲得沿階草AFLP分子指紋圖譜標記；

4）沿階草AFLP指紋圖譜庫及分析：通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染后上測序儀掃描獲得AFLP凝膠電泳分離圖譜庫，通過軟件分析獲得結果，按照相同遷移位點有擴增帶記為1，無帶為0的方法記錄電泳譜帶，并轉化為“0、1”原始數據矩陣，進行遺傳變異信息統計分析及親緣關系多態性圖譜分析，從而篩選出權利要求1所述的引物對組合從而構建沿階草AFLP分子指紋圖譜庫。

4.根據權利要求3所述的沿階草AFLP分子指紋圖譜庫的構建方法，其特征在于，所述步驟1）沿階草包括矮生102、矮生256、黑色662、黑色602、矮生302、矮生303、矮生202、細葉471、矮生246、矮生241、黑色622、黑色612、矮生312、矮生322、矮生301、細葉502、矮生311、細葉411、矮生305、矮生315、矮生212、矮生232、黑色624、細葉486、矮生293、矮生111、細葉498、矮生263、矮生282、細葉456中的一種或幾種。

5.根據權利要求3所述的沿階草AFLP分子指紋圖譜庫的構建方法，其特征在于，所述步驟2）CTAB法為改良CTAB法。

6.根據權利要求3所述的沿階草AFLP分子指紋圖譜庫的構建方法，其特征在于，所述步驟3）預擴增步驟中的預擴增引物序列如下：EcoR I 預擴引物序列: 5’-GAC TGC GTA CCAATT CA-3’，Mse I預擴引物序列: 5’-GAT GAG TCC TGA GTA AC-3’。

7.根據權利要求3所述的沿階草AFLP分子指紋圖譜庫的構建方法，其特征在于，所述步驟3）選擇性擴增中的擴增條件為：預變性 94℃2min；第一輪擴增參數：94℃30S，65℃30S，72℃80S；以后每輪循環退火溫度遞減0.7℃，擴增14輪；接著按下列參數擴增23輪：94℃30S，55℃30S，72℃80S；延伸加時72℃5min。