[發(fā)明專利]表達(dá)抗CD22嵌合抗原受體和PD-L1阻斷蛋白的細(xì)胞的制備方法、表達(dá)載體及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010891848.3
• 申請日: 2020-08-28
• 公開（公告）號: CN111944850B
• 公開（公告）日: 2023-03-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙琦;劉婕
• 申請（專利權(quán)）人: 澳門大學(xué)
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/62;C12N15/12;C12N5/10;A61K39/00;A61P35/00;A61P35/02
• 代理公司: 成都超凡明遠(yuǎn)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 51258
• 代理人: 王暉;劉書芝

本發(fā)明公開了表達(dá)抗CD22嵌合抗原受體和PD?L1阻斷蛋白的細(xì)胞的制備方法、表達(dá)載體及應(yīng)用，涉及醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域。表達(dá)載體插入有編碼抗CD22嵌合抗原受體的第一核酸和編碼PD?L1阻斷蛋白的第二核酸。利用CD22靶標(biāo)和PD?L1靶標(biāo)，通過靶向CD22的抗體或其片段，本發(fā)明的T細(xì)胞可高效、特異性地靶向表達(dá)抗原CD22的腫瘤細(xì)胞；PD?L1阻斷蛋白可以與內(nèi)源表達(dá)的PD?1競爭結(jié)合靶細(xì)胞上的PD?L1，從而阻斷PD?1/PD?L1信號通路，延長了本發(fā)明上述T細(xì)胞的作用時間，提高了腫瘤殺傷作用，由此緩解了實體瘤對CAR T細(xì)胞療法的免疫耐受性的問題。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及表達(dá)抗CD22嵌合抗原受體和PD-L1阻斷蛋白的細(xì)胞的制備方法、表達(dá)載體及應(yīng)用。

背景技術(shù)

在腫瘤治療領(lǐng)域，嵌合抗原受體T細(xì)胞療法越來越受到人們的關(guān)注。嵌合抗原受體T細(xì)胞(CAR T細(xì)胞)是被基因改造而具有嵌合抗原受體的T細(xì)胞，用于免疫治療。

嵌合抗原受體(CAR)是一種人工構(gòu)建的融合基因編碼的跨膜分子，可將T細(xì)胞特異性靶向癌細(xì)胞表面的抗原，以消除靶癌細(xì)胞。CAR由胞外結(jié)構(gòu)域(比如，抗體的單鏈抗體，scFv)、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成。胞外結(jié)構(gòu)域的scFv負(fù)責(zé)特異性抗原的識別。胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)信號的傳導(dǎo)。當(dāng)胞外結(jié)構(gòu)域和抗原特異性結(jié)合之后，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域啟動細(xì)胞活化所需的信號，從而促進(jìn)T細(xì)胞的增殖、細(xì)胞因子的釋放等。跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)饨Y(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域連接。

第一代CAR將scFv與胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域，比如CD3ζ連接，以誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞活化。隨后的CAR并入單個(第二代)或多個(第三代)其他共刺激信號，比如CD28、4-1BB或OX40的結(jié)構(gòu)域，以進(jìn)一步增強(qiáng)和維持T細(xì)胞的效應(yīng)子功能。

雖然CAR T細(xì)胞免疫療法具有高靶向性、高殺傷活性等特點，但是由于免疫檢查點分子，比如程序性死亡受體-1(PD-1)、細(xì)胞程序性死亡-配體1(PD-L1)等的存在，腫瘤分子可使CAR T細(xì)胞失活，從而逃避CAR T細(xì)胞的殺傷。

PD-1是一種重要的免疫抑制分子。PD-1主要表達(dá)于T細(xì)胞、活化的T細(xì)胞、單核細(xì)胞和自然殺傷性T細(xì)胞(Keir等)中。PD-1的結(jié)構(gòu)包括胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)尾部。PD-1屬于協(xié)同抑制受體，有2個配體，分別為PD-L1和細(xì)胞程序性死亡-配體2(PD-L2)。PD-L1在不同的惡性腫瘤，如肺癌、食管癌、卵巢癌、膀胱癌、惡性黑色素瘤和膠質(zhì)瘤中表達(dá)。在體內(nèi)，PD-1與PD-L1或PD-L2的結(jié)合，下調(diào)抗原刺激的淋巴細(xì)胞增殖以及細(xì)胞因子的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致淋巴細(xì)胞“耗盡”而誘導(dǎo)免疫耐受。實體瘤中的腫瘤細(xì)胞可上調(diào)PD-L1的表達(dá)，繼而提供下調(diào)活化T細(xì)胞的信號，最終關(guān)閉免疫反應(yīng)并誘導(dǎo)免疫耐受性。

嵌合抗原受體(CAR)T細(xì)胞療法在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中取得了巨大的成功，但在實體瘤中卻沒有取得成功，克服實體瘤對CAR T細(xì)胞療法的免疫耐受性，已經(jīng)成為亟待解決的問題。

鑒于此，特提出本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種表達(dá)抗CD22嵌合抗原受體和PD-L1阻斷蛋白的細(xì)胞的制備方法、表達(dá)載體及應(yīng)用以解決上述技術(shù)問題。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：

一種表達(dá)載體，表達(dá)載體插入有編碼抗CD22嵌合抗原受體的第一核酸和編碼PD-L1阻斷蛋白的第二核酸；

PD-L1阻斷蛋白為缺乏PD-1跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號區(qū)的PD-L1，抗CD22嵌合抗原受體的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，PD-L1阻斷蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。