[發(fā)明專利]一種高效修復(fù)環(huán)狀鐵粒幼細(xì)胞性貧血基因突變的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010889528.4
• 申請日: 2020-08-28
• 公開（公告）號: CN112442516A
• 公開（公告）日: 2021-03-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 方日國;袁鵬飛;張英馳;楊卉慧;于玲玲
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州輯因醫(yī)療科技有限公司;中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所）
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N15/54;C12N5/10
• 代理公司: 北京彩和律師事務(wù)所 11688
• 代理人: 張紅春

本發(fā)明提供一種利用基因編輯技術(shù)高效修復(fù)導(dǎo)致環(huán)狀鐵粒幼紅細(xì)胞性貧血的ALAS?2基因突變的方法，其包含利用基因編輯技術(shù)，高效安全地基因修飾患者造血干細(xì)胞的ALAS?2基因特異點(diǎn)突變，恢復(fù)ALAS?2基因表達(dá)，使亞鐵血紅素合成以及紅細(xì)胞成熟恢復(fù)至正常水平，實(shí)現(xiàn)治療疾病的目的。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因編輯治療領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及利用基因編輯技術(shù)高效修復(fù)導(dǎo)致環(huán)狀鐵粒幼紅細(xì)胞性貧血的基因突變的方法，其包含利用基因編輯技術(shù)，高效安全地基因修飾人的造血干細(xì)胞的ALAS-2基因特異的點(diǎn)突變，恢復(fù)ALAS-2基因表達(dá)，實(shí)現(xiàn)治療疾病的目的。

背景技術(shù)

遺傳性鐵粒幼紅細(xì)胞貧血(Congenital sideroblastic anemia,CSA)是一組鐵利用障礙性遺傳性疾病。特征為骨髓中出現(xiàn)大量環(huán)狀鐵粒幼紅細(xì)胞，紅細(xì)胞無效生成，組織鐵儲量過多和外周血呈小細(xì)胞低色素性貧血。目前分子水平檢測已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了7種疾病突變型，主要導(dǎo)致鐵合成、鐵硫復(fù)合物、線粒體蛋白合成障礙等病癥。其中，X鏈鎖鐵粒幼紅細(xì)胞性貧血是最普遍的疾病類型(Kaneko K,et al.Haematologica.2014)。

X鏈鎖鐵粒幼紅細(xì)胞貧血(X-linked sideroblastic anemia,XLSA)是一種罕見血液系統(tǒng)遺傳病，屬于CSA的一種，發(fā)病率不足

十萬分之一。發(fā)病人群主要是男性發(fā)病者，女性攜帶者由于正常的等位基因抑制了病態(tài)基因的表達(dá)，紅細(xì)胞的異常較少，因而這種患病家族中女性攜帶者一般無貧血，但紅細(xì)胞通常呈現(xiàn)明顯的雙向性。除少數(shù)典型病例于出生后或者嬰兒時(shí)期出現(xiàn)貧血外，大多數(shù)與10-20歲左右出現(xiàn)貧血，偶有至50-60歲并發(fā)。XLSA患者除了貧血的癥狀和體征外，鐵過載是常見的并發(fā)癥，尤其在疾病晚期，可導(dǎo)致患者死亡。患者通常由于不規(guī)則的輸血和排鐵導(dǎo)致鐵過載，使得肝臟和脾臟輕度甚至重度腫大，肝功能正常或輕度異常。鐵過載最危險(xiǎn)的臨床表現(xiàn)是心率失常，常出現(xiàn)在疾病晚期。貧血嚴(yán)重的幼兒及少年常出現(xiàn)生長發(fā)育遲緩(Wakabayashi,et al.Proc Natl Acad Sci USA.2016)。研究發(fā)現(xiàn)，XLSA的發(fā)病機(jī)理主要是由于編碼5-氨基乙酰丙酸合酶2(5-aminolevulinic acid synthase 2，ALAS-2)的基因發(fā)生突變所致。ALAS-2是調(diào)控紅細(xì)胞中催化亞鐵血紅素合成的關(guān)鍵調(diào)控因子。迄今為止，在100多個(gè)家族的患者中，發(fā)現(xiàn)了至少61種ALAS-2外顯子5-11中的突變類型，除此以外，在非編碼區(qū)尤其是內(nèi)含子-1區(qū)域的點(diǎn)突變，即Int-1-GATA(GATA-1和ALAS-2結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域)，也被報(bào)道是主要的突變類型之一(Zhang,et al.Nucliec Acids Res.2017；Campagna,etal.Am J hematol.2014)。

目前，雖然存在一些針對XLSA的治療法，例如注射大劑量的維生素B6、長期輸血和排鐵治療、異基因造血干細(xì)胞移植等方法。然而，長期的高劑量輸血伴隨去鐵劑排鐵治療導(dǎo)致鐵過載，患者的脾臟、肝臟、心臟和腎臟等重要臟器鐵大量沉積而引起的器官損傷是XLSA患兒死亡的主要原因之一。異基因造血干細(xì)胞移植技術(shù)雖然能夠根治XLSA，但是由于HLA全相合配型比例低和移植術(shù)后的GVHD(Graft-Versus-Host-Disease,移植物抗宿主反應(yīng))、免疫排斥導(dǎo)致的死亡，因此目前該治療技術(shù)難以滿足患者巨大的被治療的需求。為了解決異源造血干細(xì)胞治療技術(shù)的問題，基于基因修飾自體造血干細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因療法和基因編輯療法應(yīng)運(yùn)而生。其中，基因編輯療法的治療方案是利用基因編輯工具，如CRISPR/Cas9、鋅指核酸酶(Zinc Finer Nulease，ZFN)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcriptionactivator-like effector nucleases，TALEN)等，編輯患者的自體的造血干細(xì)胞，修復(fù)ALAS-2基因突變從而恢復(fù)ALAS-2基因的表達(dá)，再將經(jīng)過基因修飾的自體的造血干細(xì)胞回輸給患者，使患者的亞鐵血紅素合成及紅細(xì)胞狀態(tài)恢復(fù)至正常水平，達(dá)到治療疾病的目的。