[發(fā)明專利]一種高效修復(fù)環(huán)狀鐵粒幼細(xì)胞性貧血基因突變的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010889528.4
• 申請(qǐng)日: 2020-08-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112442516A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-03-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 方日國(guó);袁鵬飛;張英馳;楊卉慧;于玲玲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州輯因醫(yī)療科技有限公司;中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所）
• 主分類號(hào): C12N15/90
• 分類號(hào): C12N15/90;C12N15/54;C12N5/10
• 代理公司: 北京彩和律師事務(wù)所 11688
• 代理人: 張紅春

1.一種通過(guò)CRISPS/Cas9基因編輯校正造血干細(xì)胞的5-氨基乙酰丙酸合酶2(ALAS-2)基因突變的方法，包括：將包含對(duì)應(yīng)于ALAS-2突變序列的單鏈校正序列的供體DNA、識(shí)別ALAS-2突變序列的sgRNA和編碼Cas9蛋白的核酸序列導(dǎo)入所述造血干細(xì)胞，由此所述供體DNA中的校正序列替代所述造血干細(xì)胞中的ALAS-2突變序列。

2.權(quán)利要求1的方法，其中所述造血干細(xì)胞是CD34⁺HSPC。

3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述ALAS-2突變序列是ALAS-2基因外顯子5-11中的突變序列和/或ALAS-2基因內(nèi)含子-1中的突變序列。

4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中所述ALAS-2突變序列位于ALAS-2基因內(nèi)含子-1中。

5.權(quán)利要求4的方法，其中所述突變?yōu)锳LAS2內(nèi)含子-1中的點(diǎn)突變：X:55054635[Chr X(GRCh37/hg19):g.55054635AG,NM 000032.4:c.-15–2187TC。

6.權(quán)利要求4或5的方法，其中Cas9剪切位點(diǎn)距離ALAS-2突變位點(diǎn)不超過(guò)約11個(gè)核苷酸的位點(diǎn)。

7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述sgRNA為約17個(gè)至約20個(gè)核苷酸長(zhǎng)。

8.權(quán)利要求7的方法，其中所述sgRNA是經(jīng)化學(xué)修飾的。

9.權(quán)利要求8的方法，其中所述sgRNA的修飾包括核苷酸核糖上的2’-O-甲基化修飾或核苷酸間的3’硫代磷酸化修飾或二者。

10.權(quán)利要求9的方法，其中所述修飾為5’端的前三個(gè)核苷酸核糖上的2’-O-甲基化修飾、3’端的最后三個(gè)核苷酸核糖上的2’-O-甲基化修飾、5’端的前三個(gè)核苷酸的核苷酸間3’硫代磷酸化修飾和3’端的最后三個(gè)核苷酸的核苷酸間3’硫代磷酸化修飾。