[發明專利]一種絳紅小單孢菌短周期發酵生產低雜質慶大霉素的方法

在審

• 申請號: 202010885589.3
• 申請日: 2020-08-28
• 公開（公告）號: CN111961699A
• 公開（公告）日: 2020-11-20
• 發明（設計）人: 張德重;嚴寶冬;孫明;王勇
• 申請（專利權）人: 黑龍江格林赫思生物科技有限公司
• 主分類號: C12P19/48
• 分類號: C12P19/48;C12N1/20;C12R1/29
• 代理公司: 天津企興智財知識產權代理有限公司 12226
• 代理人: 李彥彥

1.一種絳紅小單孢菌短周期發酵生產低雜質慶大霉素的方法，其特征在于：包括以下步驟：

1)用無菌接種棒挑取慶大霉素砂土孢子或成熟母瓶孢子于茄子瓶斜面培養基進行孢子培養，培養溫度36.5-37.5℃，培養時間9-10天，培養好的孢子斜面，保存于冰箱2-8℃待用；

2)將步驟1)制備的慶大霉素孢子斜面嚴格按無菌操作，將50-60ml無菌水倒入單支斜面進行刮孢子，然后收集到經滅菌的三角瓶中，制得孢懸液；

3)將步驟2)制備的孢懸液在火焰保護下接種于滅菌后的一級種子培養基進行一級種子培養，孢懸液接種量按一級種子培養基體積的0.04％-0.08％接種，培養溫度36-37℃，培養時間48-54小時，罐壓0.04-0.06Mpa,空氣流量1：1.2-2.0[V/(V·min)]，得到慶大霉素一級種子；

4)將步驟3)制備的慶大霉素一級種子接種于滅菌后的二級種子培養基進行二級種子培養，接種量按二級種子培養基體積的8％-15％接種，培養溫度35-37℃，培養時間36-42小時，罐壓0.03-0.05Mpa,空氣流量1：1.0-1.5[V/(V·min)]，得到慶大霉素二級種子；

5)將步驟4)制備的慶大霉素二級種子接種于滅菌后的三級種子培養基進行三級種子培養，接種量按三級種子培養基體積的20％-30％接種，培養溫度35-37℃，培養時間20-24小時，罐壓0.03-0.05Mpa,空氣流量1：1.0-1.2[V/(V·min)]，得到慶大霉素三級種子；

6)將步驟5)制備的慶大霉素三級種子接種于滅菌后的發酵培養基進行發酵培養，接種量按發酵培養基體積40％的接種，發酵時間70-90小時，罐壓0.01-0.03Mpa,空氣流量1：0.6-1.0[V/(V·min)]，0-30小時培養溫度35-37℃，用無菌液堿控制pH6.5-7.2；25-35小時后培養溫度34-35℃,用無菌液堿控制pH7.0-7.8，在25-35小時補加一次732樹脂，在50-60小時再次補加732樹脂，通過732樹脂吸附得到慶大霉素發酵產物。

2.根據權利要求1所述的絳紅小單孢菌短周期發酵生產低雜質慶大霉素的方法，其特征在于：所述步驟1)中，茄子瓶斜面培養基的配方組成按質量體積分數計為：玉米淀粉0.50％-0.80％，小麥麩皮溶磷小于5000PPM、淀粉含量小于15％的小麥麩皮1.5％-2.0％，瓊脂1.5％-2.0％，天冬素0.001％-0.0013％，輕質碳酸鈣0.08％-0.12％，硝酸鉀0.08％-0.12％，氯化鈉0.03％-0.08％，硫酸鎂0.03％-0.08％，磷酸氫二鉀0.02％-0.05％，余量為水。

3.根據權利要求2所述的絳紅小單孢菌短周期發酵生產低雜質慶大霉素的方法，其特征在于：所述步驟1)具體包括如下步驟：

a、茄子瓶斜面培養基的配制：瓊脂按配制總量稱好后，放入燒杯內，加入定量的注射用水或蒸餾水煮沸溶解，除輕質碳酸鈣外的其它成份均按配制量稱好調勻后，倒入煮沸的瓊脂水中，攪勻溶解，pH值消前調至7.2-8.0，然后加入稱好輕質碳酸鈣，攪拌均勻，分裝于容量為250ml的茄子瓶中，每瓶60ml；

b、茄子瓶斜面培養基的滅菌：分裝好的茄子瓶培養基用0.11±0.01Mpa、121℃的蒸汽滅菌30min，滅菌結束時，待溫度降至70℃以下，取出培養基，搖勻即可擺成斜面，待用；

c、孢子接種與培養：將無菌操作用的無菌培養基及無菌操作的全部所用工器具解開包布放入傳遞窗，經紫外燈照射一小時后放入操作臺，于超凈臺上，在火焰保護下用無菌接種棒挑取砂土孢子于茄子瓶斜面培養基內，先劃中線，后從內到外往兩邊劃線均勻鋪開，塞好棉塞，用牛皮紙包好扎緊瓶口，置于36.5-37.5℃溫度恒溫間培養9-10天；

d、斜面孢子保存:2～8℃冰箱保存，待用。

4.根據權利要求1所述的絳紅小單孢菌短周期發酵生產低雜質慶大霉素的方法，其特征在于：所述步驟2)中，將60ml純化水倒入300ml的三角瓶中，扎口用0.11±0.01Mpa、121℃的蒸汽滅菌處理30min，冷卻至室溫，待用；將無菌操作用的無菌培養基及無菌操作的全部所用工器具解開包布放入傳遞窗，經紫外燈照射一小時后放入操作臺；于超凈臺上，嚴格按無菌操作，將50-60ml無菌水倒入斜面進行刮孢子，然后收集到經滅菌的空三角瓶中，逐瓶操作。