[發明專利]一種絳紅小單孢菌短周期發酵生產低雜質慶大霉素的方法

在審

• 申請號: 202010885589.3
• 申請日: 2020-08-28
• 公開（公告）號: CN111961699A
• 公開（公告）日: 2020-11-20
• 發明（設計）人: 張德重;嚴寶冬;孫明;王勇
• 申請（專利權）人: 黑龍江格林赫思生物科技有限公司
• 主分類號: C12P19/48
• 分類號: C12P19/48;C12N1/20;C12R1/29
• 代理公司: 天津企興智財知識產權代理有限公司 12226
• 代理人: 李彥彥

本發明涉及一種絳紅小單孢菌短周期發酵生產低雜質慶大霉素的方法，包括孢子斜面培養基、一級種子培養基、二級種子培養基、三級種子培養基和發酵培養基，該方法發酵原輔料便宜，發酵周期短，產率高，雜質少，解決了下游工序純化難、收率低的問題，滿足制備符合2020年版《中國藥典》要求的硫酸慶大霉素。

技術領域

本發明屬于抗生素發酵領域，特別涉及一種絳紅小單孢菌短周期發酵生產低雜質慶大霉素的方法。

背景技術

慶大霉素是由放線菌素屬絳紅小單孢菌、棘小單孢菌產生的一組結構相近的多組分的氨基糖苷類抗生素，以C族復合物(C1，C2，C1a，C2a)為主，還含有結構相似的西索米星、小諾霉素(C2b)、慶大霉素A、A1、A3、B、B1、X2等多種小組分，慶大霉素中各組分和小組分活性和毒性各不相同，對慶大霉素的質量控制不僅要進行組分測定，亦要嚴格控制其中的有關物質，減少毒副作用，保證用藥安全。慶大霉素發酵培養基由淀粉、玉米粉、葡萄糖、黃豆餅粉、蛋白胨、硫酸銨、硝酸鉀、氯化鈷、碳酸鈣等組成。硫酸慶大霉素的生產成本中，發酵部分占70％以上。

在慶大霉素生產過程中，由于慶大霉素是微生物的次級代謝產物，種子質量、溫度、pH值、溶氧、培養基中碳源、氮源、無機鹽等因素影響慶大霉素發酵，使得慶大霉素的發酵過程變得復雜而難以控制。慶大霉素發酵過程是微生物、化學和工程等學科的理論和技術的綜合利用，其生化反應過程機理復雜,表現出的動態行為復雜多變，對慶大霉素質量特別是組分以及有關物質控制的必然困難，慶大霉素產品中各個組分的比例與生產菌種和發酵工藝有關，不同的發酵菌種、培養基配方、發酵工藝和后期提煉精制等因素對產品質量產生較大影響。目前國內發酵生產慶大霉素，存在的主要問題是：

1、慶大霉素發酵培養基和生產工藝傳統單一，發酵單位基本在1200-1500μ/ml，發酵產率偏低，生產成本偏高。

2、慶大霉素發酵罐發酵周期較長，一般在110-160小時。

3、使用現有發酵培養基和傳統生產工藝進行發酵生產慶大霉素，雜質偏高，極大降低了提取純化收率，甚至很難持續穩定生產符合2020年版《中國藥典》的硫酸慶大霉素。

發明內容

本發明的目的就是克服上述現有技術中的缺陷，提供一種有效提高慶大霉素發酵單位，縮短發酵周期，降低生產成本，同時解決慶大霉素發酵生產中雜質高的問題的慶大霉素的培養基和培養方法。

為達到上述目的，本發明的技術方案是這樣實現的：

一種絳紅小單孢菌短周期發酵生產低雜質慶大霉素的方法，包括以下步驟：

1)用無菌接種棒挑取慶大霉素砂土孢子或成熟母瓶孢子于茄子瓶斜面培養基進行孢子培養，培養溫度36.5-37.5℃，培養時間9-10天，培養好的孢子斜面，保存于冰箱2-8℃待用；

2)將步驟1)制備的慶大霉素孢子斜面嚴格按無菌操作，將50-60ml無菌水倒入單支斜面進行刮孢子，然后收集到經滅菌的三角瓶中，制得孢懸液；

3)將步驟2)制備的孢懸液在火焰保護下接種于滅菌后的一級種子培養基進行一級種子培養，孢懸液接種量按一級種子培養基體積的0.04％-0.08％接種，培養溫度36-37℃，培養時間48-54小時，罐壓0.04-0.06Mpa,空氣流量1：1.2-2.0[V/(V·min)]，得到慶大霉素一級種子；

4)將步驟3)制備的慶大霉素一級種子接種于滅菌后的二級種子培養基進行二級種子培養，接種量按二級種子培養基體積的8％-15％接種，培養溫度35-37℃，培養時間36-42小時，罐壓0.03-0.05Mpa,空氣流量1：1.0-1.5[V/(V·min)]，得到慶大霉素二級種子；