[發明專利]單管同時檢測缺失型和非缺失型α-地中海貧血基因的熒光PCR試劑盒

有效

• 申請號: 202010884612.7
• 申請日: 2020-08-28
• 公開（公告）號: CN111961717B
• 公開（公告）日: 2023-08-01
• 發明（設計）人: 周萬軍;何偉;秦佳純;劉南松;郭威林;鄭瑜
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學;亞能生物技術（深圳）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 深圳市博銳專利事務所 44275
• 代理人: 張麗方

本發明涉及基因檢測技術領域，特別是涉及一種單管同時檢測缺失型和非缺失型α?地中海貧血基因的熒光PCR試劑盒，所述試劑盒中的引物和探針置于單管同一個反應體系之中，所述引物的Tm值高于探針的Tm值。本發明有益效果在于：本發明試劑盒只需將受檢樣本基因組DNA加入到檢測試劑中，一次性閉管操作，同時檢測缺失型和非缺失型α?地中海貧血基因，無中間環節，操作簡單且可消除PCR產物對實驗環境的污染；本發明是以當前的常規熒光定量PCR儀為儀器平臺，可實現自動化和規?；瘷z測。

技術領域

本發明涉及基因檢測技術領域，特別是涉及一種單管同時檢測缺失型和非缺失型α-地中海貧血基因的熒光PCR試劑盒。

背景技術

地中海貧血(簡稱“地貧”)是全球最常見、對人類健康影響最大的單基因遺傳病之一，主要集中在地中海沿岸國家、東南亞、少數非洲地區和我國南方，保守估計全世界攜帶者近2億人。此病源于珠蛋白基因突變而導致的α鏈或/和β鏈合成減少，即臨床上常見α-地貧和β-地貧，其中α-地貧的人群攜帶率遠高于β-地貧。人類α-地中海貧血基因簇位于16號染色體上，表達α-珠蛋白，與β-珠蛋白鏈結合，正常情況下α類和β類珠蛋白鏈比例適當(1:1)，形成具有功能的血紅蛋白四聚體。此病無有效治療手段，應用相應分析技術通過人群篩查及產前診斷阻止重癥患兒出生是國內外公認的首選預防措施。所以，簡單實用、準確靈敏的珠蛋白基因突變檢測方法，是實現此病有效防控的前提與基礎。中國常見的導致α鏈合成減少的基因缺陷包括缺失型α-地中海貧血(--^SEA、--^THAI、-α^4.2、-α^3.7)和非缺失型α-地中海貧血(WS、QS、CS點突變)。在目前的實踐之中，常規使用的跨越裂點PCR技術(也稱裂口PCR，gap-PCR)檢測大片段缺失，PCR擴增結合反向點雜交法(PCR-RDB)檢測點突變。gap-PCR技術是針對各種缺失突變進行擴增，然后再采用凝膠電泳進行產物分析；PCR-RDB是對目標序列進行PCR擴增，再通過變性、雜交、顯色等操作進行突變分析。總的來說，目前常規使用的gap-PCR和PCR-RDB，必須分別單獨檢測，成本高、工作量大、操作繁瑣、檢測通量小，難以實現自動化和標準化，且存在PCR擴增后的開管操作而造成實驗室攜帶污染的難題，不能滿足當前地貧大規模人群篩查和臨床常規分子診斷需要。

隨著目前以降低地貧患兒出生率為目標的預防計劃與措施的相繼實施，以及地貧分子機制及分子流行病學的深入研究，準確可靠、簡單實用、能實現自動化和標準化、適合大規模人群篩查和常規分子診斷的高通量檢測技術與方法，是這些項目實施的技術支撐條件，更是當前地中海貧血分子診斷的迫切需要。針對上述α-地中海貧血基因突變檢測分析的技術局限，研發相應的技術方法，一次性閉管操作以防止PCR產物攜帶污染，單反應管檢測多種突變類型以提高檢測通量且簡化操作強度，儀器自動檢測分析以實現自動和標準化，是目前方法學研究的主要方向。

發明內容

為了克服上述現有技術的缺陷，本發明所要解決的技術問題是：提供一種可以單反應管一次性閉管同步檢測α-地貧基因簇--^SEA、--^THAI、-α^4.2、-α^3.7缺失突變和α-地貧基因WS、QS、CS點突變的熒光PCR試劑盒。

為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案為：提供一種單管同時檢測缺失型和非缺失型α-地中海貧血基因的熒光PCR試劑盒，所述試劑盒中的引物和探針置于單管同一個反應體系之中，所述引物和探針具體包括：

(1)用于特異性擴增α-地中海貧血基因簇東南亞型缺失突變(--^SEA)截短序列的引物對；

用于特異性擴增α-地中海貧血基因簇泰國型缺失突變(--^THAI)截短序列的引物對；

用于特異性擴增α-地中海貧血基因簇左缺失突變(-α^4.2)截短序列的引物對；