[發明專利]分泌表達豬源性抗產腸毒素大腸桿菌K88菌毛單鏈抗體的重組乳酸乳球菌及其制備方法

有效

• 申請號: 202010883971.0
• 申請日: 2020-08-28
• 公開（公告）號: CN112011497B
• 公開（公告）日: 2022-06-07
• 發明（設計）人: 朱建國;張凡慶;王鳳青;張蕾;閆潔新;程曼玲
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/62;C12N15/74;C07K19/00;C07K16/12;C12R1/46
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 褚明偉

1.一種分泌表達豬源性抗產腸毒素大腸桿菌K88菌毛單鏈抗體的重組乳酸乳球菌，其特征在于，所述重組乳酸乳球菌攜帶分泌表達抗產腸毒素大腸桿菌K88菌毛單鏈抗體的融合序列，所述融合序列具有如SEQ ID No. 1所示序列與如SEQ ID No. 2所示的單鏈抗體序列，其中，如SEQ ID No. 1所示序列為含有分泌信號肽USP45、分泌增強信號肽LEISSTCDA和硫氧還蛋白基因的序列；

制備方法包括以下步驟：

（1）將抗產腸毒素大腸桿菌K88菌毛單鏈抗體EZZ 3序列進行優化密碼子，在5’端加上EcoR I，在3’端加上6×His序列和Hind III；所述抗產腸毒素大腸桿菌K88菌毛單鏈抗體EZZ 3序列如SEQ ID No. 2所示；

（2）設計帶有分泌信號肽USP45、分泌增強信號肽LEISSTCDA和硫氧還蛋白A基因的序列如SEQ ID No. 1所示；

（3）分別將帶有分泌信號肽USP45、分泌增強信號肽LEISSTCDA和硫氧還蛋白A基因的序列、密碼子優化的單鏈抗體EZZ 3序列依次連入pNZ8148；

（4）將步驟（3）的乳酸乳球菌表達載體電轉化入乳酸乳球菌NZ9000感受態細胞，放入培養基中培養；

（5）分離純化步驟（4）的培養基即獲得分泌表達豬源性抗產腸毒素大腸桿菌K88菌毛單鏈抗體的重組乳酸乳球菌。

2.根據權利要求1所述分泌表達豬源性抗產腸毒素大腸桿菌K88菌毛單鏈抗體的重組乳酸乳球菌，其特征在于，所述分泌表達抗產腸毒素大腸桿菌K88菌毛單鏈抗體的融合序列具有如SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列。

3.根據權利要求2所述分泌表達豬源性抗產腸毒素大腸桿菌K88菌毛單鏈抗體的重組乳酸乳球菌，其特征在于，所述核苷酸序列中進一步包含內切酶位點Nco I、Hind III，其中Nco I為CCATGG，Hind III為AAGCTT。

4.根據權利要求1所述分泌表達豬源性抗產腸毒素大腸桿菌K88菌毛單鏈抗體的重組乳酸乳球菌，其特征在于，所述分泌表達抗產腸毒素大腸桿菌K88菌毛單鏈抗體的融合序列具有如SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列。

5.一種乳酸乳球菌表達載體，其特征在于，含有分泌表達抗產腸毒素大腸桿菌K88菌毛單鏈抗體的融合序列，所述融合序列具有如SEQ ID No. 1所示序列與如SEQ ID No. 2所示的單鏈抗體序列，其中，如SEQ ID No. 1所示序列為含有分泌信號肽USP45、分泌增強信號肽LEISSTCDA和硫氧還蛋白基因的序列。

6.根據權利要求5所述的一種乳酸乳球菌表達載體，其特征在于，所述載體為原核表達載體。

7.提取權利要求1所述重組乳酸乳球菌分泌的豬源性抗產腸毒素大腸桿菌K88菌毛單鏈抗體的方法，其特征在于，將過夜培養的權利要求1所述重組乳酸乳球菌接種至培養基后，加入Nisin誘導培養5-8 h，離心誘導培養后的菌液，收集培養基上清；上清中加入脫氧膽酸鈉，靜置；加入丙酮，離心分離，獲得分泌的豬源性抗產腸毒素大腸桿菌K88菌毛單鏈抗體。