[發(fā)明專利]IV型膠原、層粘連蛋白和III型前膠原氨基端肽三聯(lián)檢測定試劑盒的制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010882813.3
• 申請日: 2020-08-28
• 公開（公告）號: CN111912992A
• 公開（公告）日: 2020-11-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 袁大豐
• 申請（專利權(quán)）人: 河北國高生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/577;G01N33/558;G01N33/543;G01N33/533
• 代理公司: 北京中仟知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11825
• 代理人: 田江飛

本發(fā)明公開了IV型膠原、層粘連蛋白和III型前膠原氨基端肽三聯(lián)檢測定試劑盒的制備方法，包括以下步驟：S1：樣品墊的制備；S2：結(jié)合墊的制備；S3：NC膜的制備；S4：裝配。本發(fā)明利用熒光免疫層析技術(shù)，采用雙抗體夾心法原理進行檢測，在層析過程中，樣本中的CIV/LN/PIIINP抗原與結(jié)合墊上的熒光微球標記的CIV/LN/PIIINP單克隆抗體反應(yīng)形成復(fù)合物，在層析作用下沿著硝酸纖維素膜向前移行至檢測區(qū)域，被硝酸纖維素膜上包被的另一株CIV/LN/PIIINP單克隆單克隆抗體捕獲并形成復(fù)合物沉積在T區(qū)，在激發(fā)光源的作用下，熒光物質(zhì)發(fā)射特定波長的熒光信號，熒光免疫分析儀俘獲熒光信號，通過信號轉(zhuǎn)化及設(shè)定的定標曲線自動轉(zhuǎn)化為定量數(shù)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及醫(yī)藥診斷技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及IV型膠原、層粘連蛋白和III型前膠原氨基端肽三聯(lián)檢測定試劑盒的制備方法。

背景技術(shù)

肝纖維化是一個病理生理過程，是指由各種致病因子所致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生。任何肝臟損傷在肝臟修復(fù)愈合的過程中都有肝纖維化的過程，如果損傷因素長期不能去除，纖維化的過程長期持續(xù)就會發(fā)展成肝硬化。IV型膠原/層粘連蛋白/III型前膠原氨基端肽主要用來檢查診斷慢性肝病患者病情發(fā)展狀況和治療效果，是衡量炎癥活動度、纖維化程度的重要依據(jù)。

III型前膠原氨基端肽反映肝內(nèi)III型膠原合成，血清含量與肝纖程度一致，并與血清γ－球蛋白水平明顯相關(guān)。PCIII與肝纖維化形成的活動程度密切相關(guān)，但無特異性，其它器官纖維化時，PCIII也升高。持續(xù)PCIII升高的慢活肝，提示病情可能會惡化并向肝硬變形成發(fā)展，而PCIII降至正常可預(yù)示病情緩解，說明PCIII 不僅在肝纖維化早期診斷上有價值，在慢性肝病的預(yù)后判斷上也有意義。

IV型膠原為構(gòu)成基底膜主要成份，反映基底膜膠原更新率，含量增高可較靈敏反映出肝纖過程，是肝纖的早期標志之一。1) 在肝纖維化時出現(xiàn)最早，適合于肝纖維化的早期診斷。2) 能反映肝纖維化程度，隨著慢遷肝→慢活肝→肝硬化→肝癌病程演病，Ⅳ-C膠原在血清含量逐步升高。3)對重癥肝炎和酒精性肝炎也顯高值。4)是藥物療效和預(yù)后觀察重要依據(jù)，血清Ⅳ-C水平與肝組織學(xué)的改變完全一致。

為基底膜中特有的非膠原性結(jié)構(gòu)蛋白，與肝纖維化活動程度及門靜脈壓力呈正相關(guān)，慢活肝和肝硬變及原發(fā)性肝癌時明顯增高 ，LN也可以反映肝纖維化的進展與嚴重程度。另外，LN水平越高，肝硬變病人的食管靜脈曲張越明顯。

層粘連蛋白1） 反映肝纖維化：正常肝臟間質(zhì)含少量LN，在肝纖維化和肝硬化時，→肌成纖維細胞增多→大量合成和分泌膠原、LN等間質(zhì)成分→形成完整的基底膜（肝竇毛細血管化）。肝竇毛細血管化是肝硬化的特征性病理改變， LN與纖維化程度和門脈高壓正相關(guān)，纖維化后期升高尤為顯著。

目前該項目大多為單項檢測，方法學(xué)多為化學(xué)發(fā)光、乳膠免疫比濁法等操作過程復(fù)雜，反應(yīng)時間長，需要配備大型檢測設(shè)備，對檢驗人員專業(yè)技術(shù)要求高，不適用于POCT應(yīng)用，因此我們提出了IV型膠原、層粘連蛋白和III型前膠原氨基端肽三聯(lián)檢測定試劑盒的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點，而提出的IV型膠原、層粘連蛋白和III型前膠原氨基端肽三聯(lián)檢測定試劑盒的制備方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

IV型膠原、層粘連蛋白和III型前膠原氨基端肽三聯(lián)檢測定試劑盒的制備方法，包括以下步驟：

S1：樣品墊的制備：

S101：樣品墊處理液的配制：按照標準配方稱取三羥甲基氨基甲烷 11-13g、鹽酸 5-6mL、聚乙烯吡咯烷酮 9-11g和S9 9-11g加入配制桶中，使其勻速攪拌進行充分溶解后，再加入鹽酸勻速攪拌進行充分混勻，然后在配置桶的內(nèi)部進行加入750-850mL的體外診斷試劑用純化水，利用體外診斷試劑用純化水定容至1000mL，得到pH在8.0±0.1范圍內(nèi)的樣品墊處理液；