[發(fā)明專利]IV型膠原、層粘連蛋白和III型前膠原氨基端肽三聯(lián)檢測定試劑盒的制備方法

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• 申請日: 2020-08-28
• 公開（公告）號: CN111912992A
• 公開（公告）日: 2020-11-10
• 發(fā)明（設計）人: 袁大豐
• 申請（專利權）人: 河北國高生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/577;G01N33/558;G01N33/543;G01N33/533
• 代理公司: 北京中仟知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 11825
• 代理人: 田江飛

1.IV型膠原、層粘連蛋白和III型前膠原氨基端肽三聯(lián)檢測定試劑盒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1：樣品墊的制備：

S101：樣品墊處理液的配制：按照標準配方稱取三羥甲基氨基甲烷 11-13g、鹽酸 5-6mL、聚乙烯吡咯烷酮 9-11g和S9 9-11g加入配制桶中，使其勻速攪拌進行充分溶解后，再加入鹽酸勻速攪拌進行充分混勻，然后在配置桶的內(nèi)部進行加入750-850mL的體外診斷試劑用純化水，利用體外診斷試劑用純化水定容至1000mL，得到pH在8.0±0.1范圍內(nèi)的樣品墊處理液；

S102:玻璃纖維素膜（SB08）的處理:將S101所述的樣品墊處理液倒入浸泡盒中，將整張玻璃纖維素膜浸泡在樣品墊處理液中25-35min，浸泡過程中使用玻璃棒進行趕走氣泡，然后將浸泡過的玻璃纖維素膜放入干燥間內(nèi)進行干燥4-6h，得到樣品墊，樣品墊利用裁切刀進行裁切成1.5cm×30.0cm規(guī)格的小樣品墊，然后將小樣品墊裝入加干燥劑的鋁箔袋中進行封口，并在鋁箔袋上進行貼指示標簽待用；

S2：結(jié)合墊的制備：

S201：抗體偶連熒光微球的制備：

S2011：取1%微球90-110ul，進行加入MES buffer850-950ul，得到混合液A,混合液A然后利用冰浴中超聲處理，冰浴中超聲處理的超聲能量為200-400W，冰浴中超聲處理的超聲時間為1-3S，然后進行間歇為2-4S，冰浴中超聲處理的總時長為2-3min，經(jīng)過超聲處理后的混合液A進行離心處理，離心處理的轉(zhuǎn)速設置為11000-13000rpm，離心處理的溫度設置為3-5℃，離心處理的離心時間設置為9-11min，得到離心液A；

S2012:將S2011中離心液A進行去除上清液，然后進行沉淀處理并加MES buffer 120-130ul、抗體0.1mg--1mg和純化水補齊液體至1ml，得到混合液B，混合液B然后利用冰浴中超聲處理，冰浴中超聲處理的超聲能量為200-400W，冰浴中超聲處理的超聲時間為1-3S，然后進行間歇為2-4S，冰浴中超聲處理的總時長為2-3min，根據(jù)羧基的含量計算使用量進行加入EDC，將加入EDC的混合液B進行通入混勻器上進行反應1.5-2.5h，經(jīng)過超聲處理后的混合液B進行離心處理，離心處理的轉(zhuǎn)速設置為11000-13000rpm，離心處理的溫度設置為3-5℃，離心處理的離心時間設置為9-11min，得到離心液B；

S2013：將S2012中離心液B進行去除上清液，然后進行沉淀處理并加MES 0.5-1.5ml，得打混合液C，混合液C然后利用冰浴中超聲處理，冰浴中超聲處理的超聲能量為200-400W，冰浴中超聲處理的超聲時間為1-3S，然后進行間歇為2-4S，冰浴中超聲處理的總時長為2-3min，經(jīng)過超聲處理后的混合液C進行離心處理，離心處理的轉(zhuǎn)速設置為11000-13000rpm，離心處理的溫度設置為3-5℃，離心處理的離心時間設置為9-11min，得到離心液C；

S2014：將S2013中離心液C進行去除上清液，然后進行沉淀處理并加MES 0.5-1.5ml，得打混合液D，混合液D然后利用冰浴中超聲處理，冰浴中超聲處理的超聲能量為200-400W，冰浴中超聲處理的超聲時間為1-3S，然后進行間歇為2-4S，冰浴中超聲處理的總時長為2-3min，超聲處理后的混合液D進行加入乙醇胺9-11ul/ml，加入乙醇胺的混合液D進行通入混勻器上進行反應25-35min，經(jīng)過均勻處理后的混合液D進行離心處理，離心處理的轉(zhuǎn)速設置為11000-13000rpm，離心處理的溫度設置為3-5℃，離心處理的離心時間設置為9-11min，得到離心液D；

S2015：將S2014中的離心液D進行去除上清液，然后進行沉淀處理并加封閉液0.4-0.6ml，得到混合液E然后利用冰浴中超聲處理，冰浴中超聲處理的超聲能量為200-400W，冰浴中超聲處理的超聲時間為1-3S，然后進行間歇為2-4S，冰浴中超聲處理的總時長為2-3min，得到抗體偶連熒光微球；

S202：結(jié)合墊處理液的配制：按照標準配方內(nèi)容稱取BSA 4-6g、吐溫200-210mL和MOPS75-85g進行加入到配制桶中進行充分溶解，然后利用體外診斷試劑用純化水定容至1000mL，得到pH在8.0±0.1范圍內(nèi)的結(jié)合墊處理液；

S203：玻璃纖維素膜的處理：將S202所述的結(jié)合墊處理液倒入浸泡盒中，將整張玻璃纖維素膜浸泡在結(jié)合墊處理液中25-35min，浸泡過程中使用玻璃棒進行趕走氣泡，然后將浸泡過的玻璃纖維素膜放入干燥間內(nèi)進行干燥4-6h，得到干燥后的玻璃纖維素膜；

S204：熒光稀釋液1的配制：稱取MES buffer20-30mM、BSA 1-2%、PVP 1-2%和蔗糖 18-22%加入到配制桶中進行充分混勻，然后利用體外診斷試劑用純化水定容至1000mL，得到pH在7.0±0.1范圍內(nèi)的熒光稀釋液1；

S205：噴涂、干燥和切割處理：將S203所述的玻璃纖維素膜按照2.5μL/cm進行噴涂S204中的熒光稀釋液1，經(jīng)過噴涂處理后的玻璃纖維素膜在干燥間內(nèi)進行干燥處理4-6h，再利用微電腦自動斬切機將干燥后的玻璃纖維素膜裁切成0.9cm×30.0cm規(guī)格的結(jié)合墊，將結(jié)合墊進行裝入加干燥劑的鋁箔袋中，最后對鋁箔袋進行封口并貼指示標簽待用；

S3：NC膜的制備：

S301：包被緩沖液的配制：將磷酸氫二鈉,十二水 10.9-11.0g和磷酸二氫鈉,二水 3-3.06g加入到配制桶中進行充分溶解，然后再利用體外診斷試劑用純化水定容至1000mL，得到pH在7.2±0.2之間的包被緩沖液；

S302：包被液的配制：按照規(guī)定比例將抗體和羊抗鼠IgG分別加入到S301所述的包被緩沖液中，各自充分混勻，然后利用體外診斷試劑用純化水定容，得到包被液；

S303：貼膜和劃膜處理：將NC膜根據(jù)PVC底板的長度裁剪成合適的尺寸，再將PVC底板中間位置的薄膜進行揭開，然后將NC膜貼在對應的位置，然后在NC膜上進行添加包被液；

S304：干燥處理：將S303中含有包被液的NC膜放入干燥間內(nèi)進行干燥4-6h，得到干燥后的NC膜；

S4：裝配：

S401：用裁紙刀將吸水紙裁成2.7cm×30cm規(guī)格的吸水條待用；

S402：將吸水條、結(jié)合墊、濾血膜和小樣品墊依次粘貼于PVC底板的規(guī)定部位，吸水條與NC膜重疊2mm，結(jié)合墊與NC膜重疊1.5mm，濾血膜與結(jié)合墊重疊2.5mm，小樣品墊與PVC底板下端對齊貼好，得到試紙片，然后試紙片按照《微電腦自動斬切機標準操作規(guī)程》的要求進行切割成（4.0mm±0.2mm）*4.0mm規(guī)格的試紙條，最后將試紙條安裝在卡殼托與卡殼蓋之間，得到檢測定試劑盒。