[發明專利]一套抑制AMH基因表達的反義RNA及促進羅非魚雄魚性腺退化和提高增重的方法

在審

• 申請號: 202010878280.1
• 申請日: 2020-08-27
• 公開（公告）號: CN111944817A
• 公開（公告）日: 2020-11-17
• 發明（設計）人: 強俊;曹哲明;徐跑;李紅霞;陶易凡;朱昊俊;馬俊蕾;劉凱
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院淡水漁業研究中心
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;A01K67/027
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 薛紅凡

本發明提供了一套抑制AMH基因表達的反義RNA及促進羅非魚雄魚性腺退化和提高增重的方法，屬于水產育種技術領域。抑制AMH基因表達的反義RNA，包括反義RNA1和反義RNA2，可以精確地抑制抗繆勒氏管激素基因mRNA的轉錄水平，干擾其mRNA轉運與翻譯，進而影響其蛋白表達水平。本發明還提供了一種促進羅非魚雄魚性腺退化和提高增重的方法，采用反義RNA序列導入技術將兩條反義RNA導入卵子中，對卵子損傷較小，成功率高。所述方法可以有效進行目標基因研究與抗病促生長新品種的開發，具有極強的應用前景。

技術領域

本發明屬于水產育種技術領域，具體涉及一套抑制AMH基因表達的反義RNA及促進羅非魚雄魚性腺退化和提高增重的方法。

背景技術

羅非魚在我國南方地區廣泛養殖，年產量超過140萬噸，位居全球第一位。養殖過程中，養殖戶偏愛養殖雄性羅非魚。因為在性成熟前，雄性羅非魚與雌性羅非魚生長沒有差異。然而，在性成熟后，雌魚卵巢發育過程中需要消耗大量的營養物質，孵化期間完全停止攝食；在護養幼魚期間攝食也很少；且一年繁殖幾次，生長顯著減慢。因而，羅非魚雄魚的生長速度比雌魚快30％以上。

抗繆勒氏管激素(anti-Müllerian hormone，AMH)基因在哺乳動物雄性性腺分化期抑制繆勒氏管形成，阻止雌性生殖管發育，使中腎管發育成附睪、輸精管和精囊。AMH基因在魚類精巢中的表達顯著高于卵巢，表明其是雄性發育過程的重要基因。

目前，常用的基因編輯技術主要有鋅指核酸酶與人工核酸內切酶技術，這些技術進行基因編輯時，脫靶的可能性極大，造成相鄰基因的變異，帶來不可預估的風險。同時，轉染時需要通過顯微注射。魚類受精卵卵殼較厚，內壓較大，因此，顯微注射時卵殼極易破碎，成功率極低。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一套抑制AMH基因表達的反義RNA，通過抑制羅非魚雄魚生長階段AMH基因的蛋白表達水平，達到促進雄性性器官退化的目的。

本發明的目的還在于提供一種促進羅非魚雄魚性腺退化和提高增重的方法，該方法對受精卵無任何傷害，成功率極高，提高羅非魚養殖經濟效益。

本發明提供了一套抑制AMH基因表達的反義RNA，包括反義RNA1和反義RNA2；

所述反義RNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述反義RNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本發明提供了一種促進羅非魚雄魚性腺退化和提高增重的方法，包括以下步驟：

1)人工合成所述反義RNA，分別克隆至含CMV啟動子的pcDNA3.1表達載體中XhoⅠ與XbaⅠ的位點之間，得到pcDNA3.1-反義RNA1和pcDNA3.1-反義RNA2；

2)以所述pcDNA3.1-反應RNA1或pcDNA3.1-反應RNA2為模板，用PolyAF2和polyAR1進行PCR擴增，得到含CMV啟動子和反義RNA1的擴增產物1或含CMV啟動子和反義RNA2的擴增產物2；

所述PolyAF2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述polyAR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

3)將所述擴增產物1、擴增產物2、陽離子脂質體Lipofecter和精子保存液混合，得到轉染試劑；

4)從性腺發育成熟的羅非魚雌魚中取成熟卵子，將所述成熟卵子與營養鹽溶液混合，加入所述轉染試劑，輕輕搖晃混合液，得到含有反義RNA的卵子；

所述營養鹽溶液包括氯化鈉4～8g/L、氯化鉀0.1～0.2g/L、氯化鈣0.05～0.12g/L、碳酸氫鈉0.05～0.15g/L、磷酸二氫鈉0.1～0.2g/L和葡萄糖0.5～1.5g/L；