[發明專利]一套抑制AMH基因表達的反義RNA及促進羅非魚雄魚性腺退化和提高增重的方法

在審

• 申請號: 202010878280.1
• 申請日: 2020-08-27
• 公開（公告）號: CN111944817A
• 公開（公告）日: 2020-11-17
• 發明（設計）人: 強俊;曹哲明;徐跑;李紅霞;陶易凡;朱昊俊;馬俊蕾;劉凱
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院淡水漁業研究中心
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;A01K67/027
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 薛紅凡

1.一套抑制AMH基因表達的反義RNA，其特征在于，包括反義RNA1和反義RNA2；

所述反義RNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述反義RNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一種促進羅非魚雄魚性腺退化和提高增重的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)將人工合成的權利要求1所述反義RNA分別克隆至含CMV啟動子的pcDNA3.1表達載體中XhoⅠ與XbaⅠ的位點之間，得到pcDNA3.1-反義RNA1和pcDNA3.1-反義RNA2；

2)以所述pcDNA3.1-反應RNA1或pcDNA3.1-反應RNA2為模板，用PolyAF2和polyAR1進行PCR擴增，得到含CMV啟動子和反義RNA1的擴增產物1或含CMV啟動子和反義RNA2的擴增產物2；

所述PolyAF2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述polyAR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

3)將所述擴增產物1、擴增產物2、陽離子脂質體Lipofecter和精子保存液混合，得到轉染試劑；

4)從性腺發育成熟的羅非魚雌魚中取成熟卵子后，將所述成熟卵子與營養鹽溶液混合，加入所述轉染試劑，輕輕搖晃混合液，得到含有反義RNA的卵子；

所述營養鹽溶液包括氯化鈉4～8g/L、氯化鉀0.1～0.2g/L、氯化鈣0.05～0.12g/L、碳酸氫鈉0.05～0.15g/L、磷酸二氫鈉0.1～0.2g/L和葡萄糖0.5～1.5g/L；

5)將所述含有反義RNA的卵子和新鮮精液混合進行人工受精，得到的受精卵進行人工孵化。

3.根據權利要求2所述方法，其特征在于，步驟2)中所述PCR擴增的反應體系為50μl，包含2×Mastermix 25μl，引物5μl，超純水18μl，模板2μl；所述PCR擴增的反應程序為：95℃預變性2min；95℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，34個循環；72℃延長5min。

4.根據權利要求2所述方法，其特征在于，步驟3)中所述擴增產物1、擴增產物2、陽離子脂質體Lipofecter和精子保存液的體積比為1:1:2:31；

所述精子保存液為包含質量濃度4％蔗糖、體積濃度3％甘油和體積濃度1％DMSO的水溶液。

5.根據權利要求2所述方法，其特征在于，步驟4)中每100粒成熟卵子用1.2～2ml營養鹽溶液處理。

6.根據權利要求2所述方法，其特征在于，步驟4)中每100粒所述成熟卵子添加0.8～1.5ml轉染試劑。

7.根據權利要求2所述方法，其特征在于，步驟4)中所述搖晃混合液的時間為12～20min。

8.根據權利要求2所述方法，其特征在于，步驟5)中每100粒成熟卵子添加0.1～0.2ml新鮮精液進行人工受精。

9.根據權利要求2或7所述方法，其特征在于，步驟5)中所述人工受精為成熟卵子和新鮮精液混合后，使用羽毛攪動30～40s，加入2ml孵化用水。

10.根據權利要求2所述方法，其特征在于，步驟6)中所述人工孵化時，水溫為27～29℃，水流速度為5～8升/分鐘。