[發明專利]化學發光免疫磁球及其制備方法

有效

• 申請號: 202010875920.3
• 申請日: 2020-08-28
• 公開（公告）號: CN112034164B
• 公開（公告）日: 2022-05-27
• 發明（設計）人: 李重陽;來祥兵;王鐸;張雪嬌;舒芹
• 申請（專利權）人: 武漢生之源生物科技股份有限公司
• 主分類號: G01N33/546
• 分類號: G01N33/546;G01N33/543;G01N21/76;C08F212/08;C08F220/18;C08F222/14;C08K3/22;C08J3/12;C08J7/12
• 代理公司: 武漢智嘉聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 42231
• 代理人: 易賢衛

1.一種化學發光免疫磁球的制備方法，其特征在于，所述化學發光免疫磁球由表面化學修飾有對苯磺酰化基團的磁性微球，同抗原或抗體偶聯所得；所述制備方法包括以下步驟：

S1、聚合以獲得表面具有多孔結構的聚苯乙烯的乳膠粒子；

S2、將S1步驟得到的乳膠粒子與亞鐵鹽的水溶液混合，通過原位還原法制備磁性復合體；

S3、將磁性復合體經羥基化改性，得到羥基化磁性微球；

S4、將羥基化磁性微球與對甲苯磺酰氯反應，即得到對甲苯磺酰化磁性微球；

S5、于氨水環境下，將所述對甲苯磺酰化磁性微球與抗原或抗體混合，反應6~8h，得到所述化學發光免疫磁球；

所述S1步驟包括以下步驟：

S11、種子乳液的制備

取乳化劑、蒸餾水、單體有機相和引發劑聚合得到種子乳液；取乳化劑和二次蒸餾水混合于燒瓶中，攪拌使其溶解，用0.1M碳酸氫鈉調節反應體系pH值為7.0~8.0；滴加單體有機相，滴加完后，高速攪拌乳化15min，形成白色均一不分層的乳液；往瓶內通氮氣5min；升溫至60℃~80℃之間，降低攪拌速度到200～220r/min，取引發劑，在30min內緩慢勻速滴入燒瓶瓶內，引發劑滴完后，繼續保溫15min，制得種子乳液；單體有機相:水:乳化劑:引發劑的體積配比為100:(500~1500):(1~3):(1~5)；其中，乳化劑的配制：稱取0.45g的十六烷基三甲基溴化銨CTAB溶解于9mL二次蒸餾水中，配成5%(w/v)的水溶液；引發劑的配制：稱取0.05g的過硫酸鉀（KPS）溶解于1mL二次蒸餾水中，配成5%(w/v)的水溶液；單體有機相的配制：將苯乙烯、丙烯酸2-乙基己基酯和二甲基丙烯酸乙二醇酯混合均勻，再加入致孔劑混合制成單體有機相；其中，致孔劑選自甲苯、鄰苯二甲酸二辛酯DOP、環己醇、正丁醇、十六醇或十二醇中的一種；苯乙烯、丙烯酸2-乙基己基酯、二甲基丙烯酸乙二醇酯和致孔劑的體積配比為(10~12):2:2:(0.1~0.5)；

S12、單體的預乳化

將乳化劑與單體有機相混合，充分攪拌至體系呈現穩定的乳液，即得到單體的預乳化液；乳化劑:單體有機相的體積配比為1:(2~4)；

S13、乳膠粒子的制備

于60℃~80℃之間，將引發劑和單體的預乳化液同時滴入到種子乳液中；升高溫度至84~86℃熟化處理1h；降低溫度至40~45℃，調節pH呈弱堿性，得到乳液；將所得乳液過篩，即可得到粒徑大小為200~500nm的聚苯乙烯的乳膠粒子；

所述S2步驟包括：

于氮氣氛圍中，取聚苯乙烯乳膠粒子的懸浮液、氯化亞鐵溶液和醋酸銨溶液混合于三口燒瓶中，攪拌混合液并升溫至70℃，用氨水將混合液的pH值調到7.0~7.2；通過恒壓滴液漏斗往反應液中緩慢均勻滴加15mL亞硝酸鈉溶液，于1小時左右滴加完畢，保持反應溫度在70℃，整個反應過程無氧氛圍，并維持反應液的pH值在7.0～7.2之間，反應完后，冷卻至室溫，抽濾，用去離子水在超聲波清洗機里反復洗滌反應產物5次，每次60s，最后置于真空干燥箱中40℃烘干24h，得到磁性復合體；

所述S3步驟包括以下步驟：

S31、磁性復合體與端環氧基聚硅氧烷混合，在冰浴并攪拌條件下，勻速滴加冰醋酸，滴加完畢后，攪拌反應3小時；其中磁性復合體與端環氧基聚硅氧烷的混合比例為(3~6)g:50ml；

S32、將反應產物抽濾，先依次用去離子水、甲醇、去離子水洗滌三次，再用0.1M NaHCO₃溶液洗滌5次，得到表面SiO₂包裹環氧基的磁性微球，干燥后用0.1M NaHCO₃稀釋成含有表面SiO₂包裹環氧基的磁性微球5%(w/w)的懸浮液；

S33、加入巰基乙醇于步驟S32得到的懸浮液中，震蕩反應10分鐘后，300mL0.1M NaHCO₃溶液洗滌3次，再用去離子水洗滌5次，得到羥基化磁性微球；巰基乙醇:表面SiO₂包裹環氧基的磁性微球的配比為(2~3)g:5mL；

所述S4包括如下步驟：

S41、用丙酮溶液置換儲存羥基化磁性微球的緩沖體系，并調節pH呈弱堿性，冷卻至-2~8℃，得到羥基化磁性微球的丙酮懸浮液；

S42、向丙酮懸浮液中滴加對甲苯磺酰氯，攪拌，反應完成后，抽濾，依次用丙酮和去離子水洗滌至中性，即可得到對甲苯磺酰化磁性微球。