[發明專利]EB病毒陰性的NK-92細胞及其制備方法

有效

• 申請號: 202010872058.0
• 申請日: 2020-08-26
• 公開（公告）號: CN111926016B
• 公開（公告）日: 2022-12-09
• 發明（設計）人: 栗鳳鵬;曹青;李華順
• 申請（專利權）人: 阿思科力（蘇州）生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N9/20;C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 蘇州三英知識產權代理有限公司 32412
• 代理人: 朱如松

本發明公開了一種EB病毒陰性的NK?92細胞及其制備方法，通過基因編輯技術成功去除了NK?92細胞中攜帶的EB病毒，獲得了EB病毒陰性的NK?92細胞株；提高了NK?92細胞的安全性，為后續以NK?92為基礎的免疫細胞藥物治療奠定基礎。

技術領域

本發明涉及技術生物醫藥技術領域，尤其是一種EB病毒陰性的NK-92細胞 及其制備方法。

背景技術

自然殺傷(NK)細胞是先天性免疫系統的重要組成部分,具有抗腫瘤、抗病毒 感染和免疫調節作用。NK細胞一直被認為是殺死癌細胞和治療感染的絕佳武器。 與T淋巴細胞不同，NK細胞無需腫瘤特異性抗原識別便可以直接殺傷腫瘤細胞, 是腫瘤免疫治療的重要效應細胞。人類NK細胞約占全血淋巴細胞的10％～15％。 目前研究認為NK細胞特異性表達CD56，而缺乏T細胞抗原CD3。由于NK細 胞純化和體外大量擴增存在一定的技術難度。因此科學家試圖建立細胞系，用同 種異體NK細胞進行腫瘤生物治療，目前國內外科學家在NK抗腫瘤研究中已先 后建立HANK、KHYG-1、NK-92、NKL、PLT、MOTN、IMC-1、NK-YS、KAI3、 SNK-1、SNK6以及YT、NK3.3等，還有通過穩定轉染IL-2獲得的NK-92MI、 IL-2/NKL、IL-2/NK3.3等轉基因NK細胞系。而NK-92細胞是1992年建立的 來自非何杰金淋巴瘤患者的NK細胞系，由于其免疫表型為CD56brightCD16-， 無ADCC效應，類似于外周血CD56brightNK細胞。目前NK-92是進入臨床研 究的重要細胞系之一，它對不同來源腫瘤的細胞系，如白血病、淋巴瘤、惡性黑 色素瘤、前列腺癌、乳腺癌等都表現出高效的殺傷活性。研究發現NK-92表達 大量的活化受體，如：NKp30、NKp46、2B4、NKG2D、CD28等，而抑制受體 的表達卻極少，只有NKGA/B和低水平的KIR2DL4與ILT-2等，幾乎完全缺乏 大多數正常NK細胞克隆表達的KIRs，如p58復合體(p58復合體通過結合靶 細胞上的HLA抗原而抑制NK細胞的殺傷)，卻保留有穿孔素和顆粒酶B介導 的細胞毒作用。它的建立，促進了其在腫瘤過繼免疫治療中的應用，并為深入開 展研究NK細胞的特征、功能、進一步揭示它在免疫系統中的確切作用，提供了 有力的研究材料。

Epstein-Barr Virus(簡稱為EBV或EB病毒)為皰疹病毒科嗜淋巴細胞屬的 成員，在人群中廣泛感染，根據血清學調查，我國3～5歲兒童EB病毒VCA-lgG 抗體陽性率達90％以上，幼兒感染后多數無明顯癥狀，或引起輕癥咽炎和上呼吸 道感染。青年期發生原發感染，約有50％出現傳染性單核細胞增多癥。主要通過 唾液傳播，也可經輸血傳染。EB病毒在口咽部上皮細胞內增殖，然后感染B淋 巴細胞，被病毒感染的細胞具有EB病毒的基因組，以環狀DNA形式游離在胞 漿或整合于染色體內，這些細胞大量進入血液循環而造成全身性感染。目前EB 病毒臨床檢測的主流方法為血清學檢測，主要檢測患者血清中的VCA、EA或EBNA1等抗原，同時也可以結合熒光定量PCR的方法對EB病毒潛伏期表達基 因EBNA進行檢測，從而確定患者EB病毒感染情況。EB病毒可長期潛伏在人 體淋巴組織中，當機體免疫功能低下時，潛伏的EB病毒活化形成得復發感染。 研究表明EB病毒主要導致原發性疾病為傳染性單核細胞增多癥，此外還與多種 人類惡性腫瘤如Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌及免疫缺陷患者的B淋巴細胞瘤等多種 癌癥的發生密切相關。

大量研究表明，NK-92細胞為EB病毒陽性細胞(Drexler HG,Dirks W, MacLeodRAF,Steube KG,Uphoff CC.Catalogue of Human and Animal Cell Lines. 8^thed.DSMZ:Braunschweig,2001.)，在基于NK-92為基礎的細胞免疫治療中，病 人存在潛在性致病風險。國內臨床相關法規已明確規定用于異體細胞治療的產品 要進行內外源病毒因子檢測，且不得檢出包含HIV、HBV、HCV、EBV、HTLV、 CMV等在內的外源性病毒(《干細胞制劑質量控制及臨床前研究指導原則(試 行)》，臨床研究用人外周血來源NK細胞制劑規范》)。