[發明專利]一種HSPG對膽道癌外周血CTC的分離鑒定及下游基因檢測方法

在審

• 申請號: 202010867780.5
• 申請日: 2020-08-26
• 公開（公告）號: CN111979196A
• 公開（公告）日: 2020-11-24
• 發明（設計）人: 易濱;袁磊;吳英俊;姜小清
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍海軍軍醫大學第三附屬醫院
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C12Q1/6869;C12Q1/6886;G16B20/00;G16B30/10;G16B35/00;G16B40/00
• 代理公司: 北京卓特專利代理事務所(普通合伙) 11572
• 代理人: 段宇

本發明提供了一種HSPG對膽道癌外周血CTC的分離鑒定及下游基因檢測方法，通過在外周血CTC中捕獲腫瘤細胞進行分離鑒定，采用DNA提取試劑盒對樣品進行DNA提取，采用高通量測序法進行膽道癌血液循環腫瘤細胞來源核酸的全基因組擴增、文庫構建、測序數據過濾和質量評估、測序深度覆蓋度統計、變異檢測、關鍵變異鑒定等的過程方法，建立一整套高通量測序分析體系，獲得腫瘤特異性分子信息用于提高特異度，通過特異性的分選抗體在血液中捕獲腫瘤細胞，進而獲悉釋放的DNA攜帶的遺傳信息的蛛絲馬跡并加以檢測分析，實現利用CTC來源核酸的基因表達水平變化與組織來源核酸的基因表達水平變化進行分析檢測DNA的方法。

技術領域

本發明涉及生物與醫學檢測技術領域，尤其涉及到一種HSPG對膽道癌外周血CTC的分離鑒定及下游基因檢測方法。

背景技術

人外周血中的循環腫瘤細胞(CirculatingTumorCell，CTC)是指從腫瘤病灶播散進入外周血循環的腫瘤細胞，并在一定條件下可發展為腫瘤轉移性病灶。由于超過90％的癌癥死亡是由轉移造成的，而CTC是腫瘤轉移的直接來源，因此從血液中分離CTC并對其進行分子檢測越來越引起人們的重視。外周血成分復雜，其中紅細胞計數5.0～6.0×1012/mL,白細胞為4.0～10.0×106/mL，而循環腫瘤細胞可能只有0～100個。目前CTC的檢測已從簡單的細胞計數，擴展到下游簇分析、分子分型、基因、轉錄和蛋白層面檢測的各個方向，在乳癌、結直腸癌、前列腺癌、肺癌已進入臨床實用，但在膽道癌的診治上仍有大量的空白。

高通量測序技術(High-throughputsequencing)又稱“下一代”測序技術(NGS)，已經對基礎研究有很大的影響，正在革命性地改變臨床的實踐技術。NGS技術廣泛應用于常規臨床實踐，包括無創產前檢測(noninvasiveprenataltest，NIPT)和胚胎植入前遺傳學診斷/篩查(preimplantationgeneticdiagnosis/preimplantationgeneticscreening，PGD/PGS)、遺傳病、腫瘤、藥物基因組等。NGS應用已經由基因組合向全外顯子測序(wholeexomesequencing，WES)和全基因組測序(wholegenomesequencing，WGS)轉變。腫瘤的NGS基因檢測目前主要針對兩類標本，一類是實體瘤組織的突變基因組panel測序，一類是外周血和尿液的液體活檢。實體瘤組織NGS受限于腫瘤取材局限于某一時點，很難反復多次，檢測結果對初診初治患者的用藥指導具有意義，但腫瘤發生發展、治療有反應、腫瘤再進展甚至轉移是會隨著時間不斷動態變化的。另外，一些轉移的患者，可能組織取材非常困難，或只能來源于部分病灶，并不能反映患者的整體腫瘤情況；因此開展基于液體活檢的CTC-NGS有很強的臨床意義。

硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(Heparansulfateproteoglycan，HSPG)是由硫酸乙酰肝素鏈結合在核心蛋白上的一組糖蛋白，在細胞表面和細胞外基質中均有分布，基質HSPG主要與細胞浸潤和遷徙有關；胞膜HSPG主要包括Syndecan和Glypican，功能涉及：作為生長因子的共同受體調節信號轉導，與粘附分子共同調節細胞遷移，結合調節胞外基質金屬蛋白酶活性等。在腫瘤發生與進展時，HSPG的含量、組分和功能出現異常，膜HSPG可與多種生長因子(如FGF、PDGF、EGF、HGF、IGF等)結合，激活相關通路。在低分化腺癌中HSPG含量升高，細胞分化程度低、伴有局部轉移、臨床分期晚期的GBC組織中HSPG硫酸化水平升高，硫酸化HSPG陽性患者化療反應性更差，生存期更短，而目前針對HSPG總體表達在膽道癌中的研究較少。