[發(fā)明專利]一種HSPG對膽道癌外周血CTC的分離鑒定及下游基因檢測方法

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• 申請日: 2020-08-26
• 公開（公告）號: CN111979196A
• 公開（公告）日: 2020-11-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 易濱;袁磊;吳英俊;姜小清
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C12Q1/6869;C12Q1/6886;G16B20/00;G16B30/10;G16B35/00;G16B40/00
• 代理公司: 北京卓特專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11572
• 代理人: 段宇

1.一種HSPG對膽道癌外周血CTC分離鑒定的方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)取樣：取來自膽道癌患者的外周血7.5mL置于抗凝管中并混勻全血標(biāo)本；

(2)對步驟(1)中采集的血樣進行去除血漿蛋白及血漿核酸，將全血中加入緩沖液，分層離心去除上清液后、輕搖離心管混勻沉淀細胞；

(3)去除紅細胞：混勻后，于離心管中加入裂解液，將離心管置于垂直混勻儀混勻，離心棄上清液，輕搖離心管混勻沉淀細胞后補加緩沖液；

(4)分層離心：于新的離心管中加入分層液，將步驟(3)中的所有液體疊加到分層液頂層，然后用緩沖液清洗離心管管壁，將清洗液同時轉(zhuǎn)移至緩沖液頂層離心；

(5)去除白細胞：離心后可見3層溶液，輕柔吸取最上2層溶液于新的離心管內(nèi)，分別加緩沖液，顛倒混勻后離心棄上清液，加入緩沖液，混勻沉淀細胞；

(6)洗滌磁微粒：吸取適量免疫脂質(zhì)磁球混懸液至EP管中，靜置后吸棄溶液，加入緩沖液混勻，靜置后棄上清液，重復(fù)3次后用緩沖液重懸磁微粒至原體積；

(7)抗體孵育：將一定量的免疫脂質(zhì)磁球緩慢加入步驟(6)處理好的樣本中，調(diào)節(jié)搖床搖速，并將離心管傾斜固定于搖床上，室溫搖動；

(8)清除游離磁微粒：將步驟(7)中離心管液體轉(zhuǎn)移至新的離心管中，靠于磁力架上靜置，將液體分別轉(zhuǎn)移至新的離心管中，架于離心管上端，離心棄上清液，分別涂至載玻片上；

(9)將載玻片在室溫下風(fēng)干，滴加4％多聚甲醛固定細胞表面抗原，滴加1％胎牛血清封閉細胞表面非特異性位點；

(10)將步驟(9)中血樣富集后獲得的載玻片分別加一抗工作液，避光孵育后，充分洗滌；

(11)將步驟(10)中的樣品加二抗工作液，避光孵育后，充分洗滌，加DAPI工作液染色后，輕微洗滌；

(12)將步驟(11)中的樣品滴甘油，蓋片讀片；并采用DNA提取試劑盒對樣品進行CTC來源基于循環(huán)腫瘤細胞的DNA提取。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種HSPG對膽道癌外周血CTC分離鑒定的方法，其特征在于：所述的步驟(7)、(8)中抗體孵育和清除游離磁微粒對外周血的循環(huán)腫瘤細胞進行捕獲的過程具體為：

S1：對已接收的血液樣本進行處理：取4mL血液加入至5mL離心管中，加入40μlHSPG免疫脂質(zhì)磁球并顛倒混勻，室溫下孵育20min；

S2：將樣本在磁力架上靜置，捕獲CTC的免疫脂質(zhì)磁球會吸附在磁力架一側(cè)，倒置磁力架和樣本，洗下離心管蓋上的樣本。靜置10分鐘，吸棄澄清液；

S3：加1mL ddH2O清洗免疫脂質(zhì)磁球；

S4：加100ul的CF1進行涂片，在37℃條件下烘干；

S5：滴加4％多聚甲醛固定8min，隨后在裝有2×SSC的37℃的水浴鍋中預(yù)熱10min；

S6：分別選用75％、85％和無水乙醇進行脫水，分別進行2min。并在室溫下風(fēng)干；

S7：加10ul熒光探針并封片，隨后置于雜交儀中76℃雜交10min，并在37℃雜交1.5h；

S8：用鑷子撕去封片膠，放入甲酰胺(43℃)中，脫落蓋玻片，浸洗10min，再采用2×SSC浸洗15min，并每5min搖晃一次；

S9：在樣本區(qū)涂100ul的CK熒光抗體染色液，并在37℃濕盒避光條件下孵育1h；

S10：洗棄CK熒光抗體染色液，用0.2％BSA洗兩次后，加10ul DAPI蓋片讀片。