[發(fā)明專利]一種胸腹水癌細(xì)胞快速檢測(cè)蛋白芯片及其制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010866140.2
• 申請(qǐng)日: 2020-08-25
• 公開（公告）號(hào): CN111999498A
• 公開（公告）日: 2020-11-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱洲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳市森盈生物科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/569
• 分類號(hào): G01N33/569;G01N33/574;G01N33/532;G01N33/543
• 代理公司: 廣州德偉專利代理事務(wù)所(普通合伙) 44436
• 代理人: 黃浩威;何文穎

1.一種胸腹水癌細(xì)胞快速檢測(cè)蛋白芯片，包括載玻片(1)，其特征在于：所述載玻片(1)通過(guò)方形陣列的方式分為多個(gè)微型陣列區(qū)域(2)，每個(gè)所述微型陣列區(qū)域(2)的內(nèi)部均附著有羧基磁珠(3)，所述羧基磁珠(3)的內(nèi)部交聯(lián)有膠體金標(biāo)記的抗腫瘤抗原特異性抗體(4)。

2.一種胸腹水癌細(xì)胞快速檢測(cè)蛋白芯片的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、膠體金制備：取1g氯金酸溶于50ml的水中，形成0.01％的氯金酸水溶液，取100mL至250mL燒杯中，加熱至沸騰后，保持沸騰的狀態(tài)下加入2.00～3.00ml的0.1mol/L檸檬酸鈉，當(dāng)氯金酸水溶液的顏色為穩(wěn)定的紅色后停止加熱，待紅色水溶液冷卻至室溫后，用100ml～200ml的蒸餾水恢復(fù)至原體積，即可得到膠體金；

S2、膠體金標(biāo)記抗體：將待標(biāo)記蛋白質(zhì)置入透析袋內(nèi)后直接放入雙蒸餾水中透析，然后在4℃的環(huán)境下離心60分鐘，取上清液；

S3、使用EDCNHS兩步法的羧基磁珠與膠體金標(biāo)記抗體交聯(lián)：利用膠體金標(biāo)記抗體緩沖液用200ml～250ml蒸餾水分餾置換并調(diào)整濃度，將膠體金標(biāo)記抗體緩沖液置換為15mM MES6.0，將膠體金標(biāo)記抗體濃度調(diào)整至2mg/mL～2.5mg/mL；

S4、在已準(zhǔn)備好的載玻片上點(diǎn)樣：對(duì)羧基磁珠與膠體金標(biāo)記抗體膠交聯(lián)后的樣品進(jìn)行點(diǎn)樣，在每個(gè)微型陣列區(qū)域進(jìn)行點(diǎn)樣，點(diǎn)好的芯片經(jīng)水化烘干后用PBS沖洗，烘干溫度在80°～90°，烘干時(shí)間為10min～15min，再用1％的BSA封閉1小時(shí)，PBS沖洗，將載玻片放入盛有PBS玻璃染色缸中，浸泡5min～7min即可，吹干后即制得胸腹水癌細(xì)胞快速檢測(cè)蛋白芯片。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種胸腹水癌細(xì)胞快速檢測(cè)蛋白芯片的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：將根據(jù)S2中的操作步驟，通過(guò)光電比色法確定標(biāo)記蛋白最適穩(wěn)定量為30～60μg/ml，形成蛋白質(zhì)溶液，調(diào)節(jié)膠體金pH至6.0～6.5，在膠體金中加入最適穩(wěn)定量的蛋白質(zhì)溶液，然后對(duì)溶液進(jìn)行離心，離心后形成沉淀物，將沉淀物溶于PEG2000緩沖液中，制成膠體金標(biāo)記抗體。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種胸腹水癌細(xì)胞快速檢測(cè)蛋白芯片的制備方法，其特征在于，根據(jù)S3之后，還包括以下步驟：

S31、羧基磁珠活化：取10mg羧基磁珠，使用15mM MES 6.0清洗3次，將羧基磁珠復(fù)懸于0.1mL的15mM MES 6.0至羧基磁珠濃度為100mg/mL，稱取EDCSulfo－NHS并溶解于15mMMES 6.0中，EDC濃度為20mg/mL，Sulfo－NHS濃度為24mg/ml，取50μL EDC，50μL Sulfo－NHS加入到清洗后的羧基磁珠中，立即混勻，羧基磁珠濃度為50mg/mL，25℃混勻狀態(tài)下活化30min；

S32、羧基磁珠與膠體金標(biāo)記抗體交聯(lián)：活化好的羧基磁珠去上清液，加入冷的15mMMES 6.0 1mL進(jìn)行清洗，共清洗2次，取調(diào)整濃度后的膠體金標(biāo)記抗體200μL(濃度為2mg/mL)加入到活化好的羧基磁珠中，立即混勻，25℃混勻條件下，反應(yīng)12－18小時(shí)；

S33、交聯(lián)后封閉及保存：反應(yīng)結(jié)束后，羧基磁珠去上清，加入緩沖液10mMPBS7.4+0.1％Tween20至羧基磁珠濃度為10mg/mL進(jìn)行清洗，重復(fù)清洗2次；加入緩沖液10mMPBS7.4+0.1％Tween20+0.1％BSA+0.01％Casein至羧基磁珠濃度為10mg/mL，室溫條件下混勻反應(yīng)30min，將羧基磁珠去上清，并復(fù)懸于緩沖液10mMPBS7.4+0.1％Tween20+0.1％BSA中，終濃度為10mg/mL，交聯(lián)完成。