[發明專利]一種全身性Plin1基因敲除動物模型構建及鑒定方法

有效

• 申請號: 202010864104.2
• 申請日: 2020-08-25
• 公開（公告）號: CN111996215B
• 公開（公告）日: 2022-08-02
• 發明（設計）人: 燕炯;許祥;馮晨毅;劉田福;陳朝陽;高學坤
• 申請（專利權）人: 山西醫科大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/89;A01K67/027
• 代理公司: 太原晉科知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 14110
• 代理人: 翟沖燕

本發明屬生物技術領域，提供一種全身性Plin1基因敲除動物模型構建及其鑒定方法。構建方法步驟為：針對Plin1基因2號外顯子前后序列設計sgRNA序列，構建Plin1基因敲除載體并進行體外轉錄獲得sgRNA；將sgRNA與Cas9蛋白混合后顯微注射入小鼠受精卵中，獲得全身性Plin1基因敲除小鼠。本項目的有益效果在于篩選出了一對評分最高的sgRNA序列，保證了項目的成功率；實現了Plin1基因2號外顯子的大片段敲除，提高了敲除效率；針對敲除區域設計3條引物，成功鑒定出了小鼠的各類基因型，避免了大片段敲除時2條引物可能無法區分基因型的情況。為研究PLIN1的生物學功能及肥胖相關代謝性疾病的發病機制提供便捷、可靠、經濟的動物模型和良好的基礎。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種全身性Plin1基因敲除動物模型構建及其鑒定方法。

背景技術

隨著經濟的快速發展和人民生活水平的提高，肥胖已經成為日益嚴重的全球性健康問題。近年數十年來，全球超重和肥胖的發病率增長明顯，并在發達國家和發展中國家中均呈快速蔓延之勢。普遍認為，近年來生活環境的改變與肥胖癥的發生有著直接的關系。不健康的飲食習慣，久坐的生活方式，缺乏運動，睡眠習慣以及文化和人口背景的變化均可能誘發肥胖。但在一項國外最新的研究中發現，遺傳因素在生活環境的改變下可能在肥胖的發生中占據著主要地位。隨著人類全基因計劃和全基因組關聯研究的日漸深入，發現了數十種與肥胖發生相關的基因，針對這些基因開展系列研究有助于全面理解肥胖的發病機制并可能為肥胖防治的提供潛在靶點。

Plin1基因位于人類15號染色體的q26區域，其DNA長度大于15 kb，包含9個外顯子和8個內含子，其多個單核酸多態性位點會增加肥胖的發生風險，被認為是肥胖相關的候選基因。在哺乳動物中，Plin1基因在白色脂肪組織中高度表達，單拷貝編碼完全定位于脂滴表面的圍脂滴蛋白（perilipin1, PLIN1），對脂滴的生物合成具有十分重要的作用。PLIN1可以增強甘油三酯（triglyceride, TG）的合成并促進單房脂滴（直徑≥10um）的形成，進而提高脂肪組織儲存脂肪的能力。同時，PLIN1還可以通過與甘油三酯脂肪酶（adiposetriglyceride Lipase, ATGL）和激素敏感性脂肪酶（hormone-sensitive lipase, HSL）相互作用，參與脂解的調節。最近還有研究表明，PLIN1可能也參與了脂肪組織中的炎癥反應。目前，對于PLIN1的生物學功能雖尚未完全闡明，但已經發現其基因表達量下調與2型糖尿病、高血壓、脂肪肝等多種代謝性疾病的發生密切相關，進一步研究Plin1基因的功能與作用對于闡明這些疾病的發病機制具有重要意義。

基因編輯技術是一種對靶基因進行定點改造的技術，在基因結構與功能研究、細胞的基因工程改造，動植物的新品種培育及疾病的基因治療方面被廣泛應用。近年來，得益于轉基因技術的發展和疾病模型構建的需要，轉基因動物成為基因編輯研究領域的一大熱點。通過運用各種方法將外源基因導入動物的基因組內，外源基因片段即可實現對動物細胞染色體的的修飾，達到在轉基因動物體內穩定遺傳的目的。轉基因動物模型的構建打破了自然界基因組序列的固有格局，使得人們可以更加深入的對基因的結構和功能進行研究，為基因及遺傳信息的研究創造了更加廣闊的平臺。

CRISPR/Cas9技術是近年來新出現的一種基因編輯技術，與鋅指核酸酶(ZFN)技術和類轉錄樣效應因子核酸酶(TALEN)技術相比，因其操作簡單、高效率和低成本的優勢在基因編輯領域被廣泛應用。