[發(fā)明專利]一種全身性Plin1基因敲除動(dòng)物模型構(gòu)建及鑒定方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010864104.2
• 申請(qǐng)日: 2020-08-25
• 公開（公告）號(hào): CN111996215B
• 公開（公告）日: 2022-08-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 燕炯;許祥;馮晨毅;劉田福;陳朝陽;高學(xué)坤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山西醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N15/89;A01K67/027
• 代理公司: 太原晉科知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 14110
• 代理人: 翟沖燕

1.一種全身性Plin1基因敲除小鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，其特征在于：所述方法基于CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)，包括以下步驟：

（1）針對(duì)Plin1基因2號(hào)外顯子前后序列設(shè)計(jì)1對(duì)sgRNA序列，通過構(gòu)建Plin1基因敲除載體及體外轉(zhuǎn)錄獲得sgRNA；

（2）將sgRNA與Cas9蛋白混合組成的Cas9 sgRNA體系的小鼠受精卵顯微注射，F(xiàn)₀代小鼠出生及鑒定，F(xiàn)₀代小鼠性成熟配繁，F(xiàn)₁代小鼠鑒定，F(xiàn)₁代陽性小鼠雌雄近交獲得F₂代小鼠，即為全身性Plin1基因敲除小鼠；

所述sgRNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示；

所述sgRNA的篩選及獲得方法為：

（1）針對(duì)小鼠Plin1基因2號(hào)外顯子序列，在NCBI中查詢小鼠Plin1基因的基本信息，應(yīng)用在線工具h(yuǎn)ttp://crispr.mit.edu設(shè)計(jì)識(shí)別Plin1基因2號(hào)外顯子前后的sgRNA序列對(duì)；

（2）根據(jù)脫靶位點(diǎn)、基因數(shù)和發(fā)生錯(cuò)配的可能性大小進(jìn)行評(píng)估篩選，選擇1對(duì)sgRNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2所示；

（3）選擇CRISPR基因敲除質(zhì)粒pX330作為載體，用限制性內(nèi)切酶BBS切割pX330質(zhì)粒BBS酶切位點(diǎn)即第245、267位置，使其線性化；

（4）向2條Plin1 sgRNA的5’端添加粘性末端后與線性化載體用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，在pX330 gRNA scafflod位置加入sgRNA序列構(gòu)建Plin1基因CRISPR/Cas9敲除載體Plin1-1，Plin1-2；構(gòu)建好的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化至DH5α菌群中，2 d后挑取單克隆菌落測(cè)序及限制性核酸內(nèi)切酶ApaLI+NcoI雙酶切法鑒定，載體序列信息如SEQ ID NO:3,4所示；

（5）按照sgRNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒即PC1380說明書設(shè)計(jì)正向引物SG1-F、SG2-F和通用下游引物SG-R，序列如SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7所示，PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄模板后進(jìn)行sgRNA轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄完全并純化后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)sgRNA片段大小及完整性。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種全身性Plin1基因敲除小鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，其特征在于：所述的方法還包括鑒定Plin1基因敲除小鼠動(dòng)物模型。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種全身性Plin1基因敲除小鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，其特征在于：所述鑒定Plin1基因敲除小鼠動(dòng)物模型的方法為：

A、待F₀代小鼠出生三周后，提取小鼠尾部DNA，利用引物F，R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳，測(cè)序鑒定基因型，引物序列如SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9所示；

B、選取F₀代陽性小鼠與野生型異性小鼠交配獲的F₁代小鼠，利用引物F、Wt/He-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳，測(cè)序鑒定基因型，引物序列如SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10所示；

C、選取F₁代陽性小鼠雌雄近交獲得F₂代小鼠，按照F₀代小鼠基因型鑒定方法獲得純合型小鼠，即為小鼠動(dòng)物模型。