[發(fā)明專利]一種母豬乳腺上皮細(xì)胞(PMEC)原代分離培養(yǎng)的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010863340.2
• 申請日: 2020-08-25
• 公開（公告）號: CN112048465A
• 公開（公告）日: 2020-12-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳浩東;劉望宏
• 申請（專利權(quán)）人: 陳浩東;劉望宏
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京盛凡智榮知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11616
• 代理人: 鮑敬

本發(fā)明涉及一種母豬乳腺上皮細(xì)胞(PMEC)原代分離培養(yǎng)的方法，包括以下步驟：(1)采樣(2)預(yù)處理；(3)分離；(4)培養(yǎng)；(5)傳代培養(yǎng)；(6)細(xì)胞純化。本發(fā)明的有益效果是：在體外建立起豬乳腺上皮細(xì)胞模型，可以避開體內(nèi)復(fù)雜的環(huán)境，研究特定條件和處理對細(xì)胞生長狀態(tài)的影響，且不受個體差異帶來的影響，以乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)物為模型來研究乳腺器官中的生物機(jī)制、疾病機(jī)理等。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物學(xué)領(lǐng)域，具體是指一種母豬乳腺上皮細(xì)胞(PMEC)原代分離培養(yǎng)的方法。

背景技術(shù)

乳腺是皮膚的附屬腺，是哺乳動物母體的一個特殊器官。它可以給幼齡動物提供含有生長所需的各種營養(yǎng)和免疫所需的乳汁。母豬乳腺組織的良好發(fā)育以及泌乳功能的正常啟動對于仔豬的生長發(fā)育、生長潛能的發(fā)揮具有重要意義。乳腺上皮細(xì)胞具有分泌功能，在乳的合成中具有重要作用。了解乳腺上皮細(xì)胞的特性可以幫助我們理解乳腺癌等乳腺相關(guān)疾病的病理機(jī)制以及為治療確定新的靶點(diǎn)。以乳腺上皮細(xì)胞為模型，充分了解乳腺發(fā)育的分子機(jī)制和功能特性，以及用乳腺上皮細(xì)胞為生物反應(yīng)器生產(chǎn)人類所需營養(yǎng)物質(zhì)等一直是研究的熱點(diǎn)問題。而大多數(shù)研究都集中在牛乳腺且比較成熟，關(guān)于豬的乳腺的研究與應(yīng)用則很少。母豬乳腺不僅可以作為代替人類乳腺進(jìn)行乳腺研究的模式器官，同時也是開發(fā)生物反應(yīng)器的理想材料。

發(fā)明內(nèi)容

以解決上述背景技術(shù)中提出的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種母豬乳腺上皮細(xì)胞(PMEC)原代分離培養(yǎng)的方法，為豬乳腺研究提供幫助。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：一種母豬乳腺上皮細(xì)胞(PMEC)原代分離培養(yǎng)的方法，包括以下步驟：(1)采樣：從屠宰場采集10月齡左右未懷孕母豬的乳腺，將整個乳房區(qū)域剪下，并置于含有1XPSN的DPBS保存液中保存，8個小時內(nèi)帶回實驗室處理；

(2)預(yù)處理：用手術(shù)剪將乳房切開，找到乳房組織部分，剪下足夠量的乳房組織，再用含有1XPSN的DPBS洗滌2-3次，然后轉(zhuǎn)移到10cm培養(yǎng)皿中，用另一滅菌手術(shù)剪剪成1mm3的小塊，也可以在無菌5ml小管里剪碎；

(3)分離：將剪碎的乳房組織轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，加入20-30ml消化液在37℃水浴消化2至3個小時，觀察消化效果以調(diào)整消化時間，直至基本上看不到小組織塊為止，確保消化完全，看不到明顯的組織塊，然后以800*g離心10分鐘，除去上清液，用DPBS洗滌沉淀一次，然后用培養(yǎng)基重懸；

(4)培養(yǎng)：將含有少量組織的重懸液，在六孔板中于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2至3天，每個孔加2-3ml培養(yǎng)基，即重懸液，2-3天后，觀察六孔板細(xì)胞生長狀態(tài)，及時換液，繼續(xù)培養(yǎng)，每隔24h左右觀察一次，看到小的組織塊都貼壁在孔板底部，周圍有細(xì)胞爬出，并且快速生長即表示培養(yǎng)初步成功，直至細(xì)胞從組織塊周圍爬出，鋪滿六孔板；

(5)傳代培養(yǎng)：當(dāng)細(xì)胞覆蓋率超過80％時，棄去培養(yǎng)基，用DPBS洗滌2-3次，然后用0.25％胰蛋白酶-EDTA消化(每隔1-2分鐘觀察消化效果，使細(xì)胞剛好消化下來，但是貼壁組織塊仍然粘附在皿底部)，加入等體積的培養(yǎng)基用以終止消化，收集消化液，離心，棄去上清液，重懸并繼續(xù)在新的六孔板中培養(yǎng)，之后再經(jīng)過第二次0.25％胰蛋白酶-EDTA消化后，將其通過70um一次性細(xì)胞過濾器過濾，然后離心，重懸并在六孔板中進(jìn)行傳代培養(yǎng)；

(6)細(xì)胞純化：利用上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對胰蛋白敏感性的差異以及兩者貼壁速度不同的特點(diǎn)，在隨后的傳代培養(yǎng)中(通常為3代)逐漸排除成纖維細(xì)胞，以獲得純化的乳腺上皮細(xì)胞。

進(jìn)一步的，所述步驟(1)采樣時選擇乳頭發(fā)育更好的乳腺。

進(jìn)一步的，所述的步驟(2)找乳房組織部分時，乳房剪開后由外向內(nèi)依此有皮層和脂肪層，再往里面會有許多小葉狀的腺泡組織，還會有實質(zhì)結(jié)構(gòu)的組織，選擇實質(zhì)結(jié)構(gòu)的組織用于乳腺細(xì)胞分離培養(yǎng)的部分。