[發明專利]一種母豬乳腺上皮細胞(PMEC)原代分離培養的方法

在審

• 申請號: 202010863340.2
• 申請日: 2020-08-25
• 公開（公告）號: CN112048465A
• 公開（公告）日: 2020-12-08
• 發明（設計）人: 陳浩東;劉望宏
• 申請（專利權）人: 陳浩東;劉望宏
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京盛凡智榮知識產權代理有限公司 11616
• 代理人: 鮑敬

1.一種母豬乳腺上皮細胞(PMEC)原代分離培養的方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)采樣：從屠宰場采集10月齡左右未懷孕母豬的乳腺，將整個乳房區域剪下，并置于含有1X PSN的DPBS保存液中保存，8個小時內帶回實驗室處理；

(2)預處理：用手術剪將乳房切開，找到乳房組織部分，剪下足夠量的乳房組織，再用含有1X PSN的DPBS洗滌2-3次，然后轉移到10cm培養皿中，用另一滅菌手術剪剪成1mm³的小塊，也可以在無菌5ml小管里剪碎；

(3)分離：將剪碎的乳房組織轉移到50ml離心管中，加入20-30ml消化液在37℃水浴消化2至3個小時，觀察消化效果以調整消化時間，直至基本上看不到小組織塊為止，確保消化完全，看不到明顯的組織塊，然后以800*g離心10分鐘，除去上清液，用DPBS洗滌沉淀一次，然后用培養基重懸；

(4)培養：將含有少量組織的重懸液，在六孔板中于37℃、5％CO2培養箱中培養2至3天，每個孔加2-3ml培養基，即重懸液，2-3天后，觀察六孔板細胞生長狀態，及時換液，繼續培養，每隔24h左右觀察一次，看到小的組織塊都貼壁在孔板底部，周圍有細胞爬出，并且快速生長即表示培養初步成功，直至細胞從組織塊周圍爬出，鋪滿六孔板；

(5)傳代培養：當細胞覆蓋率超過80％時，棄去培養基，用DPBS洗滌2-3次，然后用0.25％胰蛋白酶-EDTA消化(每隔1-2分鐘觀察消化效果，使細胞剛好消化下來，但是貼壁組織塊仍然粘附在皿底部)，加入等體積的培養基用以終止消化，收集消化液，離心，棄去上清液，重懸并繼續在新的六孔板中培養，之后再經過第二次0.25％胰蛋白酶-EDTA消化后，將其通過70um一次性細胞過濾器過濾，然后離心，重懸并在六孔板中進行傳代培養；

(6)細胞純化：利用上皮細胞和成纖維細胞對胰蛋白敏感性的差異以及兩者貼壁速度不同的特點，在隨后的傳代培養中(通常為3代)逐漸排除成纖維細胞，以獲得純化的乳腺上皮細胞。

2.根據權利要求1所述的一種母豬乳腺上皮細胞(PMEC)原代分離培養的方法，其特征在于：所述步驟(1)采樣時選擇乳頭發育更好的乳腺。

3.根據權利要求1所述的一種母豬乳腺上皮細胞(PMEC)原代分離培養的方法，其特征在于：所述的步驟(2)找乳房組織部分時，乳房剪開后由外向內依此有皮層和脂肪層，再往里面會有許多小葉狀的腺泡組織，還會有實質結構的組織，選擇實質結構的組織用于乳腺細胞分離培養的部分。

4.根據權利要求1所述的一種母豬乳腺上皮細胞(PMEC)原代分離培養的方法，其特征在于：所述的步驟(3)中的消化液包括0.1％膠原酶(Ⅰ型)、0.05％透明質酸酶、1X PSN(青鏈霉素)和DMEM/F12培養基。

5.根據權利要求1所述的一種母豬乳腺上皮細胞(PMEC)原代分離培養的方法，其特征在于：所述的培養基包括10％FBS、5ug/ml胰島素、1ug/ml氫化可的松、5ng/ml表皮細胞生長因子、1X PSN和DMEM/F12培養基。

6.根據權利要求1所述的一種母豬乳腺上皮細胞(PMEC)原代分離培養的方法，其特征在于：所述的步驟(6)的純化具體是在傳代培養時，用胰蛋白酶消化1-1.5分鐘后，大部分成纖維細胞已經被消化下來，此時將消化液棄去即可除去大部分成纖維細胞，也可加入慶大霉素來抑制成纖維細胞的生長，同樣可以達到純化目的。