[發明專利]基于宏基因組學的建庫方法和檢測試劑盒

有效

• 申請號: 202010863016.0
• 申請日: 2020-08-25
• 公開（公告）號: CN111926394B
• 公開（公告）日: 2021-05-18
• 發明（設計）人: 許騰;謝淑媚;曾偉奇;陳海如;劉足;周曉思;李永軍;王小銳;蘇杭
• 申請（專利權）人: 廣州微遠醫療器械有限公司;廣州微遠基因科技有限公司;廣州微遠醫學檢驗實驗室有限公司;深圳微遠醫療科技有限公司;微遠（深圳）醫學研究中心有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12Q1/6869
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 李海恬

本發明涉及一種基于宏基因組學的建庫方法和檢測試劑盒，屬于感染病原診斷技術領域。該基于宏基因組學的建庫方法包括以下步驟：S1：提取待測樣本中的基因組核酸；S2：在酶切體系中，使內切酶進行酶切片段化，并以末端修復酶對DNA片段進行末端修復；S3：在S2步驟得到的溶液中加入接頭和連接酶，在緩沖液體系中進行接頭連接；S4：使用磁珠對連接后的產物進行純化；S5：對純化的產物進行擴增；S6：使用磁珠對擴增的產物進行純化，去除小片段。該建庫方法適用于需要對大量樣本及多種樣本類型的核酸進行宏基因組進行建庫的實驗室，不僅提高人員和儀器的利用率，降低出錯率，還有利于保障建庫的成功率，達到24小時極致交付目標。

技術領域

本發明涉及感染病原診斷技術領域，特別是涉及一種基于宏基因組學的建庫方法和檢測試劑盒。

背景技術

宏基因組(mNGS)技術在發現和轉化研究的諸多方面已逐漸成為一種被廣泛采用的技術，在急難危重感染性疾病的病原診斷分析中有重要應用，能夠對樣本中的所有核酸進行無偏向測序，包括人源和微生物的核酸。

體外感染診斷技術可用于全部感染類型的臨床樣本的檢測，如呼吸道感染的痰液、肺泡灌洗液、咽拭子；中樞神經感染的腦脊液；血流感染的血液以及其它樣本類型，如胸腹水、組織、石蠟切片等。不同的樣本類型中由于宿主細胞及微生物含量的不同，提取的核酸質量波動很大。為了適應多樣化的樣本建庫需求，目前針對宏基因組建庫開發的商業試劑盒均針給出了一個較大范圍的建庫核酸起始投入量，并針對不同的投入量要求使用者對接頭進行合適的稀釋，以及PCR循環數做適當調整。這對于每天都需要進行大量樣本及多種樣本類型進行宏基因組構建的醫學檢驗實驗室來說，是復雜，耗費人力和PCR儀的流程，需要醫學實驗室投入更多的人力和物力保障每日的準確，及時的交付工作順利進行。

發明內容

基于此，有必要針對上述問題，提供一種標準化的基于宏基因組學的建庫方法和檢測試劑盒，該建庫方法適用于需要對大量樣本及多種樣本類型的核酸進行宏基因組進行建庫的實驗室，不僅可提高人員和儀器的利用率，降低出錯率，還有利于保障建庫的成功率，達到24小時極致交付目標。

一種基于宏基因組學的建庫方法，包括以下步驟：

S1：提取待測樣本中的基因組核酸；

S2：在酶切體系中，按照3±2ng基因組核酸：20±5mU內切酶的使用量，使內切酶進行酶切片段化，并以末端修復酶對DNA片段進行末端修復；

S3：在S2步驟得到的溶液中加入接頭和連接酶，在緩沖液體系中進行接頭連接；

S4：使用磁珠對連接后的產物進行純化，去除未正確連接、接頭短片段和殘留的接頭；

S5：對純化的產物進行擴增；

S6：使用磁珠對擴增的產物進行純化，去除小片段，使文庫峰形單一且集中。

本發明人在前期研究中發現，在宏基因組學技術中，由于不同的樣本類型中宿主細胞及微生物含量的差異，導致提取的核酸質量波動很大，而本發明人利用自身大數據的樣本優勢，在對每種樣本類型各選取了1000例左右的樣本進行核酸提取濃度的總結，發現腦脊液和血液樣本的提取濃度較低，有些情況可低于核酸濃度檢測儀的檢測下線，而痰液和肺泡灌洗液樣本的提取濃度可高至100ng/μL，總量約10-20μg，如圖1所示。

針對上述現狀，本發明對不同類型的樣本進行了研究和考察，制定出適合所用樣本類型的宏基因組建庫方法，將常規技術中需要針對不同類型樣本特點，進行個別處理調整的檢測方法，統一為標準化處理模式，不僅提高人員和儀器的利用率，降低出錯率，還有利于保障建庫的成功率。

在其中一個實施例中，所述S1步驟中，采用下述方法提取待測樣本中的基因組核酸：

樣本裂解：將待測樣本加入裂解液中，混合均勻，離心后65℃-70℃孵育10-15min，再次離心后冷卻至室溫；