[發明專利]基于宏基因組學的建庫方法和檢測試劑盒

有效

• 申請號: 202010863016.0
• 申請日: 2020-08-25
• 公開（公告）號: CN111926394B
• 公開（公告）日: 2021-05-18
• 發明（設計）人: 許騰;謝淑媚;曾偉奇;陳海如;劉足;周曉思;李永軍;王小銳;蘇杭
• 申請（專利權）人: 廣州微遠醫療器械有限公司;廣州微遠基因科技有限公司;廣州微遠醫學檢驗實驗室有限公司;深圳微遠醫療科技有限公司;微遠（深圳）醫學研究中心有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12Q1/6869
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 李海恬

1.一種基于宏基因組學的建庫方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1：提取待測樣本中的基因組核酸；

S2：在酶切體系中，先檢測S1步驟得到基因組核酸溶液濃度，再根據所得基因組核酸溶液濃度計算基因組核酸的投料體積，按照3±2ng基因組核酸：20±5mU內切酶的使用量，使內切酶進行酶切片段化，并以末端修復酶對DNA片段進行末端修復；所述內切酶為非限制性內切酶；

S3：在S2步驟得到的溶液中加入接頭和連接酶，在緩沖液體系中進行接頭連接；

S4：使用磁珠對連接后的產物進行純化，去除未正確連接、接頭短片段和殘留的接頭；

S5：對純化的產物進行擴增；

S6：使用磁珠對擴增的產物進行純化，去除小片段，使文庫峰形單一且集中。

2.根據權利要求1所述的基于宏基因組學的建庫方法，其特征在于，所述S2步驟中，末端修復酶為T4 DNA聚合酶或Klenow片段酶，按照3±2ng基因組核酸：1±0.2U末端修復酶的量加入末端修復酶；所述酶切片段化的條件為：37±0.5℃孵育25±2min；所述末端修復的條件為：65±0.5℃孵育30±2min；

所述S3步驟中，按照3±2ng基因組核酸：0.2±0.1ng接頭的量加入接頭，所述連接酶為T4 DNA連接酶，所述接頭連接的反應條件為：20±0.5℃下保持15±1min。

3.根據權利要求1所述的基于宏基因組學的建庫方法，其特征在于，所述S3步驟中，所述緩沖液體系中還包括體積百分濃度為30％-35％的PEG8000和質量百分濃度為0.0001±0.00002％的羥丙基甲基纖維素。

4.根據權利要求1-3任一項所述的基于宏基因組學的建庫方法，其特征在于，還包括S7步驟，對文庫所得產物進行單鏈環化和納米球制備，具體方法為：

按每個文庫需要產生的數據量計算每個文庫的投入質量，混合預定文庫；將混合后文庫與短接頭進行熱變性，變性后置于冰上備用；將變性后的文庫加入到單鏈環化反應體系環化反應；對環化的產物進行未環化文庫的消化，使用RNA磁珠進行純化；對純化的產物進行引物雜交和滾環擴增，即可獲得納米球。

5.根據權利要求1所述的基于宏基因組學的建庫方法，其特征在于，所述待測樣本為腦脊液、血液、痰液、肺泡灌洗液、胸腹水或尿液。

6.權利要求1-5任一項所述的基于宏基因組學的建庫方法得到的宏基因組文庫。

7.一種非診斷用途的病原檢測方法，其特征在于，包括權利要求1-5任一項所述的基于宏基因組學的建庫方法，還包括以下步驟：

測序：對構建得到的文庫進行測序；

生信分析：以生物信息學分析方法去除宿主序列，獲得病原基因信息。

8.一種基于宏基因組學的檢測試劑盒，其特征在于，包括：

酶切及末端修復試劑：包括內切酶和末端修復酶，所述內切酶的工作用量為20±5mU，所述末端修復酶的工作用量為1±0.2U；

接頭及連接試劑：包括接頭、連接酶和連接緩沖液，所述接頭的工作用量為0.2±0.1ng，所述連接酶為T4 DNA連接酶；所述連接緩沖液包括：體積百分濃度為30％-35％的PEG8000和質量百分濃度為0.0001±0.00002％的羥丙基甲基纖維素；

擴增試劑：包括PCR擴增酶，擴增緩沖液以及擴增引物；

純化試劑：包括PEG緩沖液磁珠。

9.根據權利要求8所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述純化試劑包括0.6×PEG緩沖液磁珠和0.9×PEG緩沖液磁珠。