[發明專利]一種花生線粒體DNA的提取方法

有效

• 申請號: 202010862702.6
• 申請日: 2020-08-25
• 公開（公告）號: CN111909930B
• 公開（公告）日: 2021-11-26
• 發明（設計）人: 李曉云;李麗梅;李玲
• 申請（專利權）人: 華南師范大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6806
• 代理公司: 深圳市創富知識產權代理有限公司 44367
• 代理人: 李思坪

本發明涉及分子生物學技術領域，具體涉及一種花生線粒體DNA的提取方法，為建立一種適用于提取高質量花生線粒體DNA的方法，本發明結合不同物種mtDNA提取方法的特點并對其進行優化，通過在線粒體提取液中加入甘油，并且在沉淀mtDNA時加入糖原，從而有利于花生mtDNA的提取，建立起了一種操作簡單且適用于花生mtDNA提取的方法，利用本發明方法可以有效提取花生mtDNA，所提取得到的mtDNA條帶銳利，帶型整齊，純度高，穩定性好，可應用于克隆等分子實驗以及高通量測序，滿足線粒體遺傳研究的需求，彌補了花生線粒體研究的缺陷。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，具體涉及一種花生線粒體DNA的提取方法。

背景技術

線粒體是植物維持生長發育必不可少的細胞器，也是核外重要的遺傳體系。目前，利用新一代測序平臺對線粒體DNA(簡稱mtDNA)進行高通量測序，對其序列信息進行深入解析，通過比較、分析基因組可以獲得物種分類，系統進化等信息，對探究線粒體的起源和進化具有重要的意義。在線粒體的遺傳研究中，提取高質量的mtDNA是對線粒體遺傳體系進行深入研究的基本前提。

植物mtDNA大多數為環狀分子，每個線粒體中的DNA分子數從幾拷貝到幾十拷貝不等，且不同物種的mtDNA分子差別很大，從幾十Kb到幾千Kb不等，所以對于不同物種而言，其mtDNA的提取方法很難統一。總體來說，植物mtDNA的提取方法主要有密度梯度離心和差速離心等方法，其中，密度梯度離心法得到的mtDNA雖純度高，但操作復雜，耗時；差速離心法雖然操作簡單，但所提取的mtDNA純度低，易降解。

目前已在小麥，大白菜等作物中建立了比較成熟的mtDNA提取方法。而作為重要油料作物以及主要經濟作物之一的花生，其mtDNA的提取卻尚未建立起成熟的技術。因此，建立一種適用于提取高質量花生線粒體DNA的方法顯得尤為必要。

發明內容

為了克服上述現有技術的不足，本發明提出了一種花生線粒體DNA提取方法，該方法適用于花生mtDNA的提取，所提取得到的mtDNA純度高，穩定性好，滿足線粒體遺傳研究的需求。

為了實現上述目的，本發明所采用的技術方案是：

一種花生線粒體DNA的提取方法，具體包括以下步驟：

S1、取花生幼苗根組織，加入線粒體提取液充分研磨，所述線粒體提取液包括蔗糖，焦磷酸四鈉，KH₂PO₄，EDTA，polyvinylpyrrolidone 40，BSA，cysteine，ascorbic acid和甘油，pH 7.5；

S2、對步驟S1的提取物進行過濾，收集濾液；

S3、步驟S2的濾液經離心后取上清液；

S4、步驟S3的上清液經離心后收集沉淀；

S5、往步驟S4的沉淀中加入裂解液，經懸浮后加入蛋白酶K和RNase，然后進行水浴處理，所述裂解液包括Hepes，KCl，MgCl₂，ZnSO₄，Triton X-100和SDS，pH 7.5；

S6、水浴后加入氯仿，顛倒混勻，然后進行離心處理；

S7、離心后吸取上清液，加入異丙醇、糖原和醋酸鈉，經顛倒混勻后置于-20℃中放置不少于2h；

S8、放置結束后離心去除上清，收集沉淀即得花生線粒體DNA。