[發明專利]一種花生線粒體DNA的提取方法

有效

• 申請號: 202010862702.6
• 申請日: 2020-08-25
• 公開（公告）號: CN111909930B
• 公開（公告）日: 2021-11-26
• 發明（設計）人: 李曉云;李麗梅;李玲
• 申請（專利權）人: 華南師范大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6806
• 代理公司: 深圳市創富知識產權代理有限公司 44367
• 代理人: 李思坪

1.一種花生線粒體DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、取花生幼苗根組織，加入線粒體提取液充分研磨，所述線粒體提取液包括（0.2-0.4）M 蔗糖，（4-6）mM 焦磷酸四鈉，（8-12）mM KH₂PO₄，（1-3）mM EDTA，0.5%-1.5%[w/v] 聚乙烯吡咯烷酮40，0.5%-1.5%[w/v] BSA，（4-6）mM 半胱氨酸，（15-25）mM 抗壞血酸和7%-13%[v/v]甘油，pH 7.5；

S2、對步驟S1的提取物進行過濾，收集濾液；

S3、步驟S2的濾液經離心后取上清液；

S4、步驟S3的上清液經離心后收集沉淀；

S5、往步驟S4的沉淀中加入裂解液，經懸浮后加入蛋白酶K和RNase，然后進行水浴處理，所述裂解液包括 Hepes，KCl，MgCl₂，ZnSO₄，Triton X-100和SDS，pH 7.5；

S6、水浴后加入氯仿，顛倒混勻，然后進行離心處理；

S7、離心后吸取上清液，加入異丙醇、糖原和醋酸鈉，所述糖原的終濃度為（10-20）μg/mL，所述醋酸鈉的終濃度為（0.2-0.4）M，所述異丙醇的加入量與所吸取的上清液等體積，經顛倒混勻后置于-20℃中放置不少于2 h；

S8、放置結束后離心去除上清，收集沉淀即得花生線粒體DNA。

2.根據權利要求1所述的一種花生線粒體DNA的提取方法，其特征在于，步驟S1所述花生幼苗根組織與線粒體提取液的料液比為2:（3-5）。

3.根據權利要求1所述的一種花生線粒體DNA的提取方法，其特征在于，步驟S3所述的離心為4℃，3000 g離心不少于5 min。

4.根據權利要求1所述的一種花生線粒體DNA的提取方法，其特征在于，步驟S4所述的離心為4℃，20000 g離心不少于10 min。

5.根據權利要求1所述的一種花生線粒體DNA的提取方法，其特征在于，步驟S5所述裂解液包括（40-60）mM Hepes，（100-200）mM KCl，（3-7）mM MgCl₂，（5-15）μM ZnSO₄，0.5%-2%[v/v] Triton X-100和0.03%-0.07%[v/v] SDS，pH 7.5。

6.根據權利要求1所述的一種花生線粒體DNA的提取方法，其特征在于，步驟S6所述氯仿的加入量與步驟S5水浴后的混合液等體積。