[發明專利]一種用于3D噴墨法高通量核酸原位合成的功能化表面處理方法

有效

• 申請號: 202010862060.X
• 申請日: 2020-08-25
• 公開（公告）號: CN114106588B
• 公開（公告）日: 2023-01-03
• 發明（設計）人: 張滿倉;王立兵;候彩鈴
• 申請（專利權）人: 上海迪贏生物科技有限公司
• 主分類號: C09C1/30
• 分類號: C09C1/30;C09C3/04;C09C3/06;C09C3/12;C09C3/08;B29C64/106;B33Y10/00
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 王春霞

本發明公開了一種用于3D噴墨法高通量核酸原位合成的功能化表面處理方法。該方法如下步驟：將基底的表面進行富羥基化處理；在基底的表面修飾疏水性分子；疏水性分子不與亞磷酰胺單體反應；采用多通道壓電噴墨頭組件將蝕刻墨水噴射到基底表面的預設區域進行微蝕刻；蝕刻墨水采用疏水性分子反應的氟鹽類化合物配制；在基底的表面修飾親水性分子即可。通過本發明方法可在基底表面形成特定區域圖案化的功能表面，然后可直接用相同的多通道壓電噴墨頭組件進行后續高分辨率的亞磷酰胺單體和核酸合成，與現有方法比較無需昂貴的光刻設備與反復的位置校準設計，降低了合成成本；還可提高功能化位點上的可用活性位點密度，提高單條寡核苷酸的產量。

技術領域

本發明涉及一種用于3D噴墨法高通量核酸原位合成的功能化表面處理方法，屬于合成生物學領域。

背景技術

高通量寡核苷酸合成作為合成生物學的有力工具。傳統的寡核苷酸合成方法是基于亞磷酰胺化學的柱式合成，每個寡核苷酸是在單獨一個合成管或在合成板中的一個柱子中合成的，每種核酸的產量較高，一般為nmol量級，但合成中消耗的試劑量多成本也高，合成通量有限。新一代DNA合成技術主要是通過大規模平行合成技術實現了寡核苷酸的高通量合成。高通量寡核苷酸合成主要包括光化學芯片原位合成法、電化學原位合成法、微流控合成法和3D噴墨打印原位合成法等。光化學芯片原位合成受限于光敏脫保護單體的高成本和合成長度短的問題已經局限在基因芯片等極少量應用場景。電化學原位合成法由于合成錯誤率高的問題逐漸被淘汰。基于微流控的合成方法需要引入微泵微閥等使得其結構相對復雜操作麻煩效率降低，也未成為主流方式。基于玻片或硅片微陣列的3D噴墨打印法原位合成方法，合成的通量高，合成成本低，合成長度更長，逐漸成為目前主流的高通量寡核苷酸合成方式。

原位噴墨打印法的核心難點之一是解決在作為DNA合成的載體的玻片或硅片基底表面如何不通過物理間隔實現每個液滴化學反應的獨立分區，也就是通過表面的基團的疏水性和親水性差異實現將液滴穩定在特定位置，或者說通過高低不同的表面自由能實現活性化學反應和惰性物理分區。目前的玻片處理法通常采用不同比例的硅烷化試劑，一般包括親水硅烷和疏水硅烷的不同比例的混合。親水硅烷提供的親水基團用與后續亞磷酰胺單體反應以進行合成，疏水硅烷提供的疏水基團幫助液滴利用表面張力穩定在特定位置。玻片表面通常是均一的，均勻分布著大量的疏水基團和少量的親水基團。這是因為其表面需要具備較強的疏水性以利于反應試劑即“墨滴”降落至玻片后維持良好的形態，從而保證不同種類的單體既能相互靠近，提高通量，又能互不干擾，提高序列準確性。然而，在玻片的處理過程中，疏水性的提升通常采用帶有疏水基團的試劑對玻片上的親水基團-羥基進行封閉化處理，但是羥基是DNA合成的反應位點，這勢必伴隨著反應位點的減少，即每種序列DNA分子產量的降低。概括地講，傳統的玻片處理方式存在親水-疏水、產量-通量的對立統一關系。基于硅片表面的功能化表面處理利用復雜的光刻技術將100-300nm的電磁輻射通過特定圖案化的掩膜來制造出特定的反應區域，使得非照射區域內包含低自由能的疏水分子，也就是合成惰性基團，照射區域內包含高自由能的親水分子。但是該方法需要將光刻設備和打印設備整合，特別是在打印過程中需要復雜的校準才能報證打印落點精度的落到光刻后的活性區域。復雜精密的固定和對準裝置使得設備成本很高。對準也就是合成活性基團，復雜的光刻掩膜和裝置使得硅片處理成本顯著增加。同時不透明的硅材料打印無法用于基因芯片等診斷產品開發。除了光學處理另外還有基于MEMS加熱元件的局部處理用于高通量DNA合成的研究。上述用于3D噴墨法高通量核酸原位合成的功能化表面處理方法各有優劣，因此，需要繼續開發新的能夠滿足相關應用需求的高效率低成本的用于3D噴墨法高通量核酸原位合成的功能化表面處理方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于3D噴墨法高通量核酸原位合成的功能化表面處理方法，經本發明處理后的表面可以利用多通道壓電噴墨頭組件同時進行液滴原位蝕刻以及后續將功能基團添加到表面進行無需校準的高效寡核酸合成，解決了目前需要利用復雜光刻技術和對準裝置的功能化表面處理方法的高成本問題以及傳統玻片的功能化表面處理方式的產量和通量無法同時提高的矛盾。