[發明專利]一種基于細胞朝向的定量去核方法

有效

• 申請號: 202010861832.8
• 申請日: 2020-08-25
• 公開（公告）號: CN111944852B
• 公開（公告）日: 2022-06-07
• 發明（設計）人: 趙啟立;趙新;邱金禹;孫明竹;韓宇;賈祎晴
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12N15/877
• 分類號: C12N15/877;C12N5/075;G06F30/23
• 代理公司: 天津睿勤專利代理事務所(普通合伙) 12225
• 代理人: 孟福成

本發明涉及一種基于細胞朝向的定量去核方法，包括以下步驟：S1，對細胞核抽取過程有限元建模確定去核所需胞質去除量在關于細胞核?微針相對位置下的分布；S2，對細胞核進行染色在熒光場下定位細胞核相對于極體的三維分布范圍；S3，結合以上兩步結果確定一個極體在焦平面上點位作為去核操作時的細胞朝向；S4，轉動細胞至該方向吸取定量胞質進行去核。本發明利用細胞核抽取過程的有限元建模與離線確定的細胞核相對于極體三維分布范圍確定去核時的極體點位，自動控制胞質去除量，可實現10％去核量下96％的去核成功率。

技術領域

本發明涉及細胞級別的顯微操作領域，具體涉及一種基于細胞朝向的定量去核方法。

背景技術

細胞去核在指將受體卵母細胞中含有遺傳物質的細胞核去除的操作，是克隆操作的關鍵步驟。在細胞去核過程中過多的損失胞質會使克隆胚胎失去過多的營養物質，繼而導致胚胎發育失敗或降低胚胎發育潛力。因此去核操作中在細胞核完全去除的前提下應該盡可能減少胞質量去除量。

目前，現有的細胞去核操作主要有以下幾種方式：(1)使用特殊化學物質浸泡去核；(2)激光、X光或紫外線照射細胞核的部位，使細胞核喪失功能；(3)使用磁力驅動微刀片或者微流道對細胞進行二分切割去核；采用以上三種常用方式對細胞進行去核時，主要存在以下缺陷：a、特殊化學物質浸泡細胞實現功能性去核時，遺留的化學物質會對后續引入的供體基因的表達不利；b、X光、激光照射細胞核區域會使得細胞基因喪失表達能力，且激光和X光產生的能量會破壞細胞核周圍的胞質活性，降低克隆胚胎發育潛力；c、使用磁力驅動微刀片或者微流道對細胞進行二分切割，拋棄含有細胞核的那一半也可以去核，但巨大的胞質損失使其難以應用到克隆操作中。

為了減少細胞去核操作對細胞本身的傷害。目前，主要采用顯微鏡下，控制微針抽取細胞核，具體方法為：操作者在顯微鏡下使用吸持針固定卵母細胞，控制斜口微針從三點鐘方向刺入卵母將細胞核吸取出來。但是，這種去核方法，在實際應用過程中，主要存在以下問題：由于家畜卵母細胞胞質顏色較深，埋藏在胞質內的細胞核一般不可見。采用熒光染色雖然可以使細胞核可見，但熒光場下無法對微針位置與胞質去除量進行計算，使得微針運動控制與去核體積控制難以進行。

經研究表明，在MII期細胞核一般位于第二極體附近，通過調整極體在顯微鏡下焦平面上的點位(即：細胞的朝向)，使細胞核在微針刺入細胞之后能夠離針口近一些，從理論上可以實現以抽取較少的胞質就可以將細胞核吸入針管。然而，由于較小去核量完成去核所需的細胞核-斜口微針相對位置與細胞核相對于極體的三維分布均未可知，因此，很難確定一個具體的極體點位作去核時的最佳細胞朝向。所以，開發一種去核方法確定合適的細胞朝向，并基于該細胞朝向實現以較少胞質完成完全去核十分有必要。

發明內容

為了實現去核操作中在細胞核完全去除的前提下盡可能減少胞質量去除量，本發明提出了一種基于細胞朝向的定量去核操作方法，該方法利用胞質吸取過程有限元建模確定以較少胞質去除量完成去核的細胞核相對微針的位置范圍以及標定細胞核相對極體的三維分布范圍，利用幾何關系計算獲得定量去核所需的極體點位作為去核中的細胞朝向完成卵母細胞去核。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案是：一種基于細胞朝向的定量去核方法，包括以下步驟：

S1，通過對細胞核抽取過程進行有限元建模，獲得微針針管周圍不同潛在細胞核位置處在細胞核抽取過程中完成去核所需胞質去除量的分布，并確定以較少胞質去除量完成去核的細胞核相對微針的位置范圍；

S2，在離線條件下，對熒光染色細胞核進行三維定位，并與在明場下確定的極體三維位置進行對比，獲得細胞核相對于極體的三維分布范圍；

S3，利用幾何關系計算得到胞質去除量較少時，極體在焦平面上的點位角θ，并將該焦平面上的極體點位作為細胞去核過程中細胞的朝向；

S4，撥動細胞將極體轉動到所述焦平面上設定點位，定量控制胞質去除量進行細胞去核。