[發明專利]一種USP7抑制劑在治療ABC-DLBCL藥物中的應用

在審

• 申請號: 202010859627.8
• 申請日: 2020-08-24
• 公開（公告）號: CN111840562A
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發明（設計）人: 吳圓圓;范義輝
• 申請（專利權）人: 南通大學
• 主分類號: A61K45/00
• 分類號: A61K45/00;A61P35/00;C12Q1/686;G01N15/14;G01N21/64;G01N33/68
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 錢超

1.一種USP7抑制劑在治療ABC-DLBCL藥物中的應用。

2.根據權利要求1所述的一種USP7抑制劑在治療ABC-DLBCL藥物中的應用，其特征在于步驟為：

第一步，USP7表達與ABC型DLBCL的關系：確定USP7是否與ABC型DLBCL相關，首先研究USP7在DLBCL細胞系中的表達情況，然后通過數據庫分析USP7在腫瘤組織中的表達情況；

第二步，明確USP7是否參與ABC型DLBCL的發生發展及其所發揮的具體作用：用USP7小分子抑制劑抑制USP7活性，CCK-8法觀察ABC型DLBCL細胞增殖、PI染色和流式細胞術檢測細胞凋亡的影響及應用Western blot、Real-time PCR 方法檢測抑制劑對ABC型DLBCL BCR信號通路的影響，具體實施步驟為：

CCK-8檢測：取對數生長期的細胞，完全培養基重懸，細胞計數；取無菌 96 孔板，設計0uM、0.5uM、1uM、5uM、10uM、20uM 六個P22077濃度組，每個濃度 4 個副孔；每孔接種 2×10⁴cells，加含上述濃度藥物的完全培養基至 200μl，37℃、5%CO₂條件下繼續培養48h，在各孔內加入 20μl CCK-8試劑，37℃孵育 4 小時；取出 96 孔板，放入酶標儀，設置檢測波長為 450nm，檢測并紀錄 OD450 讀數；

PI染色實驗：取對數生長期細胞，以20000細胞／孔接種于96孔扳，同時給藥處理，培養24或48h后加入終濃度為50uｇ／ｍＬ的ＰＩ染料，避光染色10min，采用熒光顯微鏡觀察拍照；

流式細胞術：6 孔板內接種對數生長期的各組細胞，培養 24 小時；重懸后收集每孔細胞于單支的流式管內，離心去上清，PBS 洗滌細胞 2 次，每管中緩慢加入 1ml、-20℃預冷的 70%乙醇， 4℃過夜；離心去除乙醇，PBS 洗滌細胞，離心 5min；每管加入 500μl PI/RNase Staining Buffer 重懸細胞，室溫下避光孵育 15min后上機檢測；

應用Real-time PCR、Western blot方法檢測抑制劑對ABC型DLBCL BCR信號通路的影響：用10uM P22077處理ABC型DLBCL細胞（HBL），分別提取mRNA和蛋白，Real-time PCR法檢測 BTK, PLCG2, PKC 和 CD79B 及BCR-NFkB 信號通路靶基因IL-6, MYC, BATF3 和IRF4的mRNA水平；Western blot方法檢測BTK和PLCG2的蛋白水平。

3.根據權利要求2所述的一種USP7抑制劑在治療ABC-DLBCL藥物中的應用，其特征在于：所述第一步中研究USP7在DLBCL細胞系中的表達情況具體步驟為應用Western blot方法檢測ABC型DLBCL及GCB型DLBCL細胞系中USP7 蛋白表達，和GCB-DLBCL亞型相比USP7在ABC型DLBCL中高表達，這種表達差異證實USP7參與ABC-DLBCL的發生。

4.根據權利要求2所述的一種USP7抑制劑在治療ABC-DLBCL藥物中的應用，其特征在于：所述第一步中數據庫分析顯示和癌旁組織相比，USP7在腫瘤組織中高表達。

5.根據權利要求2所述的一種USP7抑制劑在治療ABC-DLBCL藥物中的應用，其特征在于：USP7小分子抑制劑P22077可明顯誘導DLBCL特別是ABC-DLBCL（HBL-1、SU-DHL-2）發生凋亡。