[發明專利]一種脊髓成纖維細胞的制備方法

在審

• 申請號: 202010858593.0
• 申請日: 2020-08-24
• 公開（公告）號: CN112094805A
• 公開（公告）日: 2020-12-18
• 發明（設計）人: 王文朝;馬會旭;張正東;李軍;劉雷
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

本發明公開了一種脊髓成纖維細胞的制備方法，1)取脊柱組織，用含雙抗的磷酸鹽緩沖液清洗至無血細胞，再用培養液沖洗至椎管中無脊髓；2)取步驟1)所得干凈組織，剪成塊，加含雙抗的磷酸鹽緩沖液離心，取下層組織塊，加胰蛋白酶溶液消化，再加培養液離心，取下層固體，加培養液重懸；3)取步驟2)所得重懸細胞，接種于培養液中培養至細胞密度達85～95％，用胰蛋白酶溶液消化后重鋪細胞，再培養30～40min，棄去培養液和未貼壁細胞，加培養液培養至細胞密度達85～95％，即得。本發明脊髓成纖維細胞的制備方法，簡便高效，制備得到的脊髓成纖維細胞純度高。

技術領域

本發明具體涉及一種脊髓成纖維細胞的制備方法。

背景技術

脊髓損傷(SCI)是脊柱損傷最嚴重的并發癥，導致損傷節段以下肢體嚴重的功能障礙，不僅會給患者本人帶來身體和心理的嚴重傷害，還會給整個社會造成巨大的經濟負擔，針對脊髓損傷的治療和康復一直是當今醫學界的研究熱點和難點。

SCI后神經元軸突的再生是損傷后修復的細胞學基礎和神經功能恢復的關鍵，其中提高軸突內生力、縮短軸突再生時間是SCI后神經功能恢復的保障。SCI后軸突的再生不僅要穿過損傷區域連通失神經支配的靶點，還要生成新的突觸并形成有效的突觸傳遞。以上再生過程主要與SCI后微環境中神經營養因子、髓磷脂相關抑制因子以及瘢痕形成有密切關系。研究證實，SCI后瘢痕形成對軸突再生和神經功能恢復起到主要的抑制作用，瘢痕的形成是一系列、動態、復雜的過程。在損傷后7天左右，成纖維細胞(fibroblasts)由損傷區域臨近的硬脊膜和血管外周細胞的入侵，而后激活、增生肥大，最終形成纖維瘢痕，其對突觸再生和功能恢復起著機械屏障和生物抑制作用：(1)活動性增生肥大且分泌細胞外基質(extracellular matrix,ECM)，包括：IV型膠原、纖維連接蛋白和層粘連蛋白等，形成阻礙突觸生長的機械屏障；(2)分泌多種的突觸生長抑制分子：NG2蛋白聚糖、肌腱蛋白C、semaphorin 3A和EphB2等，形成了阻礙功能恢復的生物障礙。通過抑制成纖維細胞的激活和增殖，實現抑制SCI后纖維瘢痕的形成，可以為軸突再生創造良好的微環境。

目前作為研究基礎的脊髓成纖維細胞難以獲得，市面上尚未有脊髓成纖維細胞系，亦未有見針對原代脊髓成纖維細胞的提取的公認、公開、可行的方法。

發明內容

為解決上述問題，本發明提供了一種脊髓成纖維細胞的制備方法，它包括如下步驟：

1)取脊柱組織，用含雙抗的磷酸鹽緩沖液清洗至無血細胞，再用培養液沖洗至椎管中無脊髓；

2)取步驟1)所得干凈組織，剪成塊，加含雙抗的磷酸鹽緩沖液離心，取下層組織塊，加胰蛋白酶溶液消化，再加培養液終止消化，離心，取下層固體，加培養液重懸；

3)取步驟2)所得重懸細胞，接種于培養液中培養至細胞密度達85～95％，用胰蛋白酶溶液消化后重鋪細胞，再培養30～40min，棄去培養液和未貼壁細胞，加培養液培養至細胞密度達85～95％，即得。

進一步地，步驟1)所述脊柱組織是包含脊髓的新鮮脊柱組織。

進一步地，所述含雙抗的磷酸鹽緩沖液是含1％雙抗的磷酸鹽緩沖液；所述磷酸鹽緩沖液濃度為0.01mol/L，pH值7.4。

進一步地，所述培養液是含10％胎牛血清和1％雙抗的DMEM細胞培養基。

進一步地，步驟2)所述干凈組織剪成0.5-1mm³的塊狀；所述干凈組織與含雙抗的磷酸鹽緩沖液的質量體積比1～5g：10ml，優選1g：10ml；所述加含雙抗的磷酸鹽緩沖液離心的速度1000rpm/min，時間3min。