[發(fā)明專利]一種脊髓成纖維細胞的制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010858593.0
• 申請日: 2020-08-24
• 公開（公告）號: CN112094805A
• 公開（公告）日: 2020-12-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王文朝;馬會旭;張正東;李軍;劉雷
• 申請（專利權(quán)）人: 四川大學(xué)
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 成都高遠知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

1.一種脊髓成纖維細胞的制備方法，其特征在于：它包括如下步驟：

1)取脊柱組織，用含雙抗的磷酸鹽緩沖液清洗至無血細胞，再用培養(yǎng)液沖洗至椎管中無脊髓；

2)取步驟1)所得干凈組織，剪成塊，加含雙抗的磷酸鹽緩沖液離心，取下層組織塊，加胰蛋白酶溶液消化，再加培養(yǎng)液終止消化，離心，取下層固體，加培養(yǎng)液重懸；

3)取步驟2)所得重懸細胞，接種于培養(yǎng)液中培養(yǎng)至細胞密度達85～95％，用胰蛋白酶溶液消化后重鋪細胞，再培養(yǎng)30～40min，棄去培養(yǎng)液和未貼壁細胞，加培養(yǎng)液培養(yǎng)至細胞密度達85～95％，即得。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述提取方法，其特征在于：步驟1)所述脊柱組織是包含脊髓的新鮮脊柱組織。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述提取方法，其特征在于：所述含雙抗的磷酸鹽緩沖液是含1％雙抗的磷酸鹽緩沖液；所述磷酸鹽緩沖液濃度為0.01mol/L，pH值7.4。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述提取方法，其特征在于：所述培養(yǎng)液是含10％胎牛血清和1％雙抗的DMEM細胞培養(yǎng)基。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述提取方法，其特征在于：步驟2)所述干凈組織剪成0.5-1mm³的塊狀；所述干凈組織與含雙抗的磷酸鹽緩沖液的質(zhì)量體積比1～5g：10ml，優(yōu)選1g：10ml；所述加含雙抗的磷酸鹽緩沖液離心的速度1000rpm/min，時間3min。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述提取方法，其特征在于：步驟2)所述胰蛋白酶溶液的加入量為下層組織塊的10倍量v/w，ml/g；所述加胰蛋白酶溶液消化時間10～20min，優(yōu)選15min；所述終止消化的培養(yǎng)液加入量為胰蛋白酶溶液的2倍量v/v，ml/ml；所述離心的速度1000rpm/min，時間5min。

7.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述提取方法，其特征在于：步驟2)所述胰蛋白酶溶液濃度為0.1～0.15％，優(yōu)選0.125％。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述提取方法，其特征在于：步驟2)所述加培養(yǎng)液重懸至細胞密度1.2-1.6×10⁵個/ml。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述提取方法，其特征在于：步驟3)所述培養(yǎng)條件為溫度37℃，CO₂濃度5％；所述重懸細胞接種于培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后換液，再持續(xù)培養(yǎng)至細胞密度85～95％期間，每48h換液一次。

10.根據(jù)權(quán)利要求1或9所述提取方法，其特征在于：所述重懸細胞接種于培養(yǎng)液中培養(yǎng)至細胞密度達90％。

11.根據(jù)權(quán)利要求1所述提取方法，其特征在于：步驟3)所述胰蛋白酶溶液的加入量為每5×10⁵個細胞加1ml胰蛋白酶；所述胰蛋白酶溶液濃度為0.2～0.3％，優(yōu)選0.25％；所述消化至細胞回縮變圓、透亮、輕拍瓶壁呈流沙樣脫落。

12.根據(jù)權(quán)利要求1所述提取方法，其特征在于：步驟3)所述加培養(yǎng)液至覆蓋培養(yǎng)容器底部；所述加培養(yǎng)液培養(yǎng)期間每2～3天換液一次。