[發明專利]一種環介導等溫擴增檢測流感嗜血桿菌的試劑盒及使用方法

在審

• 申請號: 202010857027.8
• 申請日: 2020-08-24
• 公開（公告）號: CN111850152A
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發明（設計）人: 范列英;司玉瑩;李根;陸柳;張雯雁;葉揚琴
• 申請（專利權）人: 上海市東方醫院（同濟大學附屬東方醫院）
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12R1/21
• 代理公司: 上海驍象知識產權代理有限公司 31315
• 代理人: 林煒

本發明公開了一種環介導等溫擴增檢測流感嗜血桿菌的試劑盒，包括上游外部引物F3，其序列如SEQ ID NO:1所示，下游外部引物B3，其序列如SEQ ID N0:2所示，上游內部引物FIP，其序列如SEQ ID N0:3所示，下游內部引物BIP，其序列如SEQ ID NO:4所示，環引物LF，其序列如SEQ ID NO:5所示。本發明的試劑盒具有特異性強、靈敏度高等特點，檢測流感嗜血桿菌操作簡單、價格低廉、耗時短，適用于欠發達地區醫療單位推廣使用。

技術領域

本發明屬于生物醫學技術領域，涉及一種試劑盒，具體來說是一種環介導等溫擴增檢測流感嗜血桿菌的試劑盒及使用方法。

背景技術

流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae，Hi)是一種革蘭氏陰性桿菌，由于在人工培養中，必需在培養基中加入新鮮血液，Hi才能生長，故命名為“嗜血桿菌”。根據莢膜多糖成分，Hi可分為a–f6個血清型和不可分型流感嗜血桿菌(NTHi)。在這幾種亞型Hi中，b型(Hib)毒性最強，是導致機體感染的最主要流感嗜血桿菌，能引起腦膜炎、中耳炎、骨髓炎、肺炎、關節炎和其他軟組織感染。在老年人群中，Hib是急性下呼吸道感染最主要的病原菌、而慢性支氣管炎常由NTHi引起。在小兒，特別是嬰幼兒，除了引起急性呼吸道感染，Hib也是引起腦膜炎的主要病原菌，必須高度重視

流感嗜血桿菌和其他病原引起的呼吸道感染的臨床癥狀非常相似，因而很難通過臨床表現來判斷患者是否感染了流感嗜血桿菌，只能通過實驗室診斷進行鑒定。臨床上的常規的檢測方法包括菌落的分離、培養，然后再采用生化方法鑒定菌種，耗時3天，且操作復雜、檢測成本高。目前也有少數實驗室采用聚合酶鏈式反應(PCR)技術檢測。PCR法快速、靈敏度特異性高，但實驗設備價格較高、耗時長，且需要專業人員進行操作，難以在基層或欠發達地區進行推廣使用。

環介導等溫擴增(LAMP)是一種新型的核酸檢測方法，只需要加入4-6條引物便可在BstDNA聚合酶的作用下在63℃恒溫下進行核酸擴增。與PCR相比，LAMP只需要恒溫即可進行擴增，不需要復雜的變溫步驟，而且檢測時間更短，45min即可得到結果。值得一提的是，LAMP的靈敏度更好，檢測限可達10拷貝數/反應，由于引物是根據靶序列的6個不同區域設計的，因此具有高度特異性。基于它的多種優點，LAMP已逐漸被用于各種核酸檢測和診斷應用中。

目前現有的LAMP檢測流感嗜血桿菌的試劑盒，都是使用鈣黃綠素通過終點顯色法判斷結果。但終點顯色法必須在60min時立刻觀察結果，否則時間過長極易出現假陽性結果影響判斷。終點顯色法通過裸眼觀察顏色變化從而判斷結果，這樣的操作非常容易引起誤差。因此我們利用實時熒光曲線進行結果判斷，SYBR Green I是一種能夠激發綠色激發光的染料，能夠與雙鏈DNA的雙螺旋小凹槽區域進行結合，使得該區域的熒光增強。通過實時熒光檢測儀能夠得到實時熒光曲線，得到更加清晰直觀的結果。

發明內容

針對現有技術中的上述技術問題，本發明提供了一種環介導等溫擴增檢測流感嗜血桿菌的試劑盒及使用方法，所述的這種環介導等溫擴增檢測流感嗜血桿菌的試劑盒及使用方法要解決現有技術中針對現有的流感嗜血桿菌檢測時間長、成本高且操作復雜的技術問題。

本發明的環介導等溫擴增檢測流感嗜血桿菌的試劑盒，包括如下的引物：

具體引物序列如下：

上游外部引物F3：TGAGCTACAAAAAGGCGA(SEQ ID NO:1所示)

下游外部引物B3：GGATCAACATCATACAAACGAC(SEQ ID NO:2所示)

上游內部引物FIP：CACTCATCAAACGAATGAGCGTAAAAATCGGGATTTTAGGGC(SEQ ID NO:3所示)