[發明專利]肝包蟲基因片段篩選方法、擴增引物及試劑盒

在審

• 申請號: 202010854980.7
• 申請日: 2020-08-24
• 公開（公告）號: CN113355431A
• 公開（公告）日: 2021-09-07
• 發明（設計）人: 曾勇;吳泓;廖明恒;袁克非;徐琳
• 申請（專利權）人: 四川大學華西醫院
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11;G16B30/10
• 代理公司: 成都云縱知識產權代理事務所(普通合伙) 51316
• 代理人: 劉沙粒;伍星

肝包蟲基因片段篩選方法、擴增引物及試劑盒，該篩選方法通過從細粒棘球絳蟲、多房棘球絳蟲的全基因組中排出人類基因組、近親緣關系絳蟲組基因組的影響，篩選得到第三細粒棘球絳蟲基因片段、第三多房棘球絳蟲基因片段和共同基因片段，并分別以三類基因片段設計三類擴增引物；通過進一步篩選得到用于檢測人體組織的包蟲病的引物對組，基于該引物對組提供試劑盒及試劑盒使用方法。本發明從根源上避免了由于待檢測組織DNA中存在的人類基因或近親緣關系絳蟲基因所導致的假陽性，且引物在設計時所針對的待檢測DNA為人體組織樣本，顯著降低了臨床檢測中的假陰性結果，特異性引物的準確率更高、特異性更強，顯著增強引物對和試劑盒的臨床應用效果。

技術領域

本發明涉及包蟲病診斷領域，具體涉及一種肝包蟲基因片段篩選方法，基于該方法篩選得到的引物，用于檢測人體組織的包蟲病的引物、試劑盒及檢測方法。

背景技術

包蟲病，又稱棘球蚴病，是因棘球絳蟲幼蟲寄生于人或動物體內，引起的一種人獸共患的寄生蟲病。我國西藏、新疆、寧夏、甘肅、內蒙、青海等畜牧業發達地區為包蟲病流行區，受威脅人口接近6600萬。西藏地區是全國包蟲病疫情最嚴重的省份之一，調查顯示，包蟲病流行區人群平均患病率為1.66％，約4.99萬人，早期感染人數不低于10萬人。

包蟲病的感染可導致肝、肺、腦及骨骼等器官和組織的損害，病人喪失勞動能力，是部分農牧區群眾因病致貧、因病返貧的主要原因之一。同時，包蟲病還具備可傳染、可潛伏、感染早期難以檢測的寄生蟲病特征，若撲殺不完全，會給疫區民眾帶來“因病致貧”的沉重負擔。

中國的包蟲病主要包括囊型包蟲病(cystic echinococcosis,CE)和泡型包蟲病(alveolar echinococcosis,AE)，其中，囊型包蟲病由細粒棘球絳蟲(Echinococcosisgranulosus,Eg)的幼蟲棘球蚴寄生人體組織器官所致，而泡型包蟲病由多房棘球絳蟲(Echinococcosis multilocularis,Em)的幼蟲泡球蚴寄生所致。泡型包蟲病病人如不治療，10年病死率可達94％，又被稱為“蟲癌”。

傳統的包蟲病診斷方法中，B超、CT等影像技術以及病理檢查因自身限制，容易造成小病灶、非典型病灶的誤診、漏診和分型困難；血清篩查缺乏有效手段，ELISA，IHA和dot-ELISA等免疫學檢測敏感性較低，不適用于人群篩查及隨訪。

為了解決上述問題，專利CN107164479A公開了一種用于檢測和鑒定人組織包蟲病病原的引物對組合及試劑盒，其基于細粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲已知的數個基因型設計多重PCR引物，采用多重PCR方法檢測和鑒定三種人包蟲病病原，特異性強、靈敏度高。但是，由于該引物對組合基于特定數個的細粒或多房棘球絳蟲的基因型進行設計，未排除人類基因及其他絳蟲基因的影響，檢測時無法排除假陽性；同時，這些引物在設計時所針對的待檢測DNA主要為絳蟲蟲體DNA樣本，當推廣到臨床包蟲病患者肝臟感染病灶時，容易出現假陰性的結果，造成誤診；此外，多重PCR法雖然能夠實現同一體系、同一反應條件下同步檢測兩個以上的不同靶基因，但引物對之間也易發生互補結合、產生干擾反應，導致特異性較差、診斷結果不可靠。專利CN109762910A提供了一種用于同時檢測兩型包蟲病的引物及試劑盒，能夠實現通過單管PCR擴增即可對三個棘球絳蟲種單獨或混合感染引起的兩型包蟲病進行診斷和鑒別。同理地，該診斷方法也采用多重PCR法，且該引物的設計基于狹義細粒棘球絳蟲、加拿大棘球絳蟲和多房棘球絳蟲線粒體基因參考序列，未采用絳蟲的全基因組，也未排除人類基因及其他絳蟲基因的影響，應用于臨床時容易出現假陽性結果，特異性較差甚至無法擴增。

發明內容

本發明的一個目的在于提供一種肝包蟲基因組特異性序列的篩選方法，該方法基于細粒棘球絳蟲、多房棘球絳蟲以及其余人類易感且已知全基因組數據的絳蟲的全基因組數據，進行BLAST比對、mummer比對，排除了人類基因組、非細粒或多房棘球絳蟲基因組的污染影響，篩選出細粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲共同的基因片段，以及兩種絳蟲各自的差異基因片段。