[發(fā)明專利]肝包蟲基因片段篩選方法、擴(kuò)增引物及試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010854980.7
• 申請日: 2020-08-24
• 公開（公告）號(hào): CN113355431A
• 公開（公告）日: 2021-09-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曾勇;吳泓;廖明恒;袁克非;徐琳
• 申請（專利權(quán)）人: 四川大學(xué)華西醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12Q1/6888
• 分類號(hào): C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11;G16B30/10
• 代理公司: 成都云縱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 51316
• 代理人: 劉沙粒;伍星

1.肝包蟲基因片段篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：

獲取基因組數(shù)據(jù)，下載細(xì)粒棘球絳蟲、多房棘球絳蟲、近親緣關(guān)系絳蟲組、以及人類的基因組數(shù)據(jù)；

排除人類基因影響，細(xì)粒棘球絳蟲的基因組、多房棘球絳蟲的基因組分別與人類基因組比對，排除細(xì)粒棘球絳蟲的基因組中與人類基因組相同的基因片段，得到第一細(xì)粒棘球絳蟲基因片段；排除多房棘球絳蟲的基因組中與人類基因組相同的基因片段，得到第一多房棘球絳蟲基因片段；

排除近親緣關(guān)系絳蟲基因影響，第一細(xì)粒棘球絳蟲基因片段、第一多房棘球絳蟲基因片段分別與近親緣關(guān)系絳蟲組的基因組比對，排除第一細(xì)粒棘球絳蟲基因片段中與近親緣關(guān)系絳蟲組的基因組相同的基因片段，得到第二細(xì)粒棘球絳蟲基因片段，排除第一多房棘球絳蟲基因片段中與近親緣關(guān)系絳蟲組的基因組相同的基因片段，得到第二多房棘球絳蟲基因片段；

篩選目的基因片段，比對第二細(xì)粒棘球絳蟲基因片段和第二多房棘球絳蟲基因片段，篩選出相同的基因片段作為共同基因片段，第二細(xì)粒棘球絳蟲基因片段中與共同基因片段存在差異的基因片段作為第三細(xì)粒棘球絳蟲基因片段，第二多房棘球絳蟲基因片段中與共同基因片段存在差異的基因片段作為第三多房棘球絳蟲基因片段。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述第三細(xì)粒棘球絳蟲基因片段、第三多房棘球絳蟲基因片段和共同基因片段均滿足以下條件：0.4≤GC％≤0.7，發(fā)卡dG＝0，二聚體分值≤4，以及1個(gè)錯(cuò)配。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述近親緣關(guān)系絳蟲組包括微口膜殼絳蟲、鏈狀帶絳蟲、鋸齒狀絳蟲、石渠棘球絳蟲中的至少一種。

4.基于權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的篩選方法篩選的基因片段的擴(kuò)增引物，其特征在于，所述擴(kuò)增引物包括第一擴(kuò)增引物、第二擴(kuò)增引物和第三擴(kuò)增引物中的至少一種，其中，所述第一擴(kuò)增引物用于擴(kuò)增第三細(xì)粒棘球絳蟲基因片段，第二擴(kuò)增引物用于擴(kuò)增第三多房棘球絳蟲基因片段，第三擴(kuò)增引物用于擴(kuò)增共同基因片段。

5.用于檢測人體組織的包蟲病的引物對組，其特征在于，所述引物對組包括細(xì)粒棘球絳蟲特異性引物對和多房棘球絳蟲特異性引物對中的至少一種，以及共同檢測引物對，其中：

細(xì)粒棘球絳蟲特異性引物對的序列表如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

多房棘球絳蟲特異性引物對的序列表如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；

共同檢測引物對的序列表如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

6.用于檢測人體組織的包蟲病的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求5所述的引物對組。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，還包括PCR擴(kuò)增體系。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增體系包括DNA聚合酶和無核酸酶水。

9.權(quán)利要求6～8中任一項(xiàng)所述的試劑盒的使用方法，其特征在于，包括以下步驟：

提取待檢測組織DNA；

采用試劑盒的PCR擴(kuò)增體系以及共同檢測引物對擴(kuò)增所述待檢測組織DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳，記錄電泳結(jié)果，根據(jù)電泳結(jié)果判斷待檢測組織是否感染細(xì)粒棘球絳蟲和/或多房棘球絳蟲；和/或

采用試劑盒的PCR擴(kuò)增體系以及細(xì)粒棘球絳蟲特異性引物對和多房棘球絳蟲特異性引物對中的至少一種擴(kuò)增所述待檢測組織DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳，記錄電泳結(jié)果，根據(jù)電泳結(jié)果判斷待檢測組織感染的棘球絳蟲種類。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的使用方法，其特征在于，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s；35個(gè)循環(huán)；72℃加長延伸5min。