[發明專利]檢測狂犬病毒糖蛋白抗原的酶聯免疫試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 202010854943.6
• 申請日: 2020-08-24
• 公開（公告）號: CN111999497B
• 公開（公告）日: 2023-08-08
• 發明（設計）人: 董春娜;張蕾;宋芳;肖進;齊鵬;李靜;李鵬宇;劉新月
• 申請（專利權）人: 中牧實業股份有限公司
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;G01N33/569;G01N33/543;G01N33/535;G01N33/577
• 代理公司: 北京惟誠致遠知識產權代理事務所(普通合伙) 11536
• 代理人: 王慧鳳;李巍

本發明公開了一種特異性定量檢測狂犬病毒糖蛋白抗原的酶聯免疫試劑盒及其應用。該試劑盒包括作為捕獲抗體包被的酶聯反應板和酶標抗體的單克隆抗體。所述單克隆抗體重鏈可變區：CDR1如序列1的第31～36位氨基酸所示；CDR2如序列1的第51～66位氨基酸所示；CDR3如序列1的第99～105位氨基酸所示；輕鏈可變區：CDR1如序列2的第24～40位氨基酸所示；CDR2如序列2的第56～62位氨基酸所示；CDR3如序列2的第95～103位氨基酸所示。采用狂犬病毒的特異性單克隆抗體制成的酶聯免疫定量檢測試劑盒，靈敏度高、特異性強，可以有效地區分并檢測樣品中狂犬病毒糖蛋白抗原的含量。

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，更具體地，本發明涉及一種特異性定量檢測狂犬病毒糖蛋白抗原的酶聯免疫檢測試劑盒，適用于狂犬病毒糖蛋白抗原的特異、快速、準確檢測。

背景技術

狂犬病毒是彈狀病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒屬(Lyssavirus)的成員。根據對狂犬病毒N蛋白單克隆抗體以及G蛋白系列的分析和鑒定，全球各地的狂犬病毒主要分成4個血清型。其中血清1型即為人們所熟知的地理分布最廣、對世界人民健康威脅最大的狂犬病毒，包括野病毒和固定毒實驗室株(如SAD)。隨著現代分子生物學的研究進展，參照狂犬病毒核蛋白(N?protein)基因N端500個核苷酸的相似率，狂犬病毒屬被分成7種基因型，基因型2～6只在歐洲和非洲發現。

狂犬病毒為不分節段的單股負鏈RNA病毒，其基因組總長度約1,2000nt，主要編碼五種已知的結構蛋白：核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質蛋白(M)、糖蛋白(G)和依賴RNA的RNA多聚酶(L)。在狂犬病毒感染過程中，人和動物機體既可以產生細胞免疫應答又可以產生體液免疫應答。主要侵害神經細胞、T淋巴細胞為主的淋巴細胞，但對B淋巴細胞影響較小。在此過程中，病毒免疫除了與G蛋白有關外，現在逐步發現與N蛋白和P蛋白也與病毒免疫相關。N基因長度為1350-1353nt，編碼N蛋白(Nucleoprotien)，主要負責包裝病毒基因組RNA。由于N基因的含量豐富，并且其編碼的N蛋白易于被熒光抗體方法檢測，所以N基因和N蛋白在抗原診斷及進化分析中應用最廣泛的。

目前測定狂犬病毒糖蛋白抗原的方法主要免疫熒光法、RT-PCR核酸檢測法、病毒分離的方法主要包括細胞培養分離和乳鼠接種法分離，由于以上檢測方法都必須在P2或P3實驗室中完成，并且上述方法也必須專業的實驗人員和設備才能夠完成，且耗時較長，根本無法滿足大范圍的快速診斷需求，因而，需要開發一種操作便捷，特異，靈敏、準確、可靠的狂犬病毒糖蛋白抗原檢測方法。

目前，酶聯免疫吸附試驗(Enzyme-Linked?ImmunosorbentAssays,ELISA)是市場上主流的免疫測定技術，已廣泛應用于臨床檢測，快速便捷且靈敏度高，且不需要特殊的儀器設備。伴隨著單克隆抗體技術的發展，各種病原的抗原檢測方法得到了前所未有的發展，由于單克隆抗體是針對抗原上單一表位篩選制備的抗體，因此能夠敏感特異地識別狂犬病毒糖蛋白抗原，為基于單克隆抗體技術的狂犬病毒糖蛋白抗原檢測方法奠定了基礎，目前還未檢索到有關狂犬病抗原定量檢測的酶聯免疫吸附試驗的檢測方法，因此本發明具有獨創性和新穎性。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于特異性定量檢測狂犬病毒糖蛋白抗原的酶聯免疫試劑盒，該試劑盒利用一株可以與狂犬病毒糖蛋白抗原特異性結合的單克隆抗體RV1作為捕獲抗體及檢測抗體，建立了一種特異性、敏感性和重復性好的狂犬病毒糖蛋白抗原檢測方法，用于檢測疫苗生產過程中的培養液、滅活液、純化液、濃縮液和破乳后的成品疫苗等中的狂犬病毒糖蛋白抗原含量。

基于上述目的，本發明的特異性定量檢測狂犬病毒糖蛋白抗原酶聯免疫試劑盒，包括以捕獲抗體包被的酶聯反應板和酶標檢測抗體。所述酶標檢測抗體優選為經辣根化物酶標記抗體，所述辣根過氧化物酶可通過戊二醛法或過碘酸法交聯在檢測抗體上。捕獲抗體和檢測抗體均為與狂犬病毒糖蛋白抗原特異性結合的單克隆抗體RV1。