[發明專利]一種豬肝臟組織類器官模型及其體外構建方法

有效

• 申請號: 202010854860.7
• 申請日: 2020-08-24
• 公開（公告）號: CN111979179B
• 公開（公告）日: 2022-12-27
• 發明（設計）人: 蔡德敏;劉好雨;李豪;辛子蒙;張可欣;顧昊天;李艷偉
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 王麗霞

1.一種豬肝臟組織類器官模型的體外構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1，將剪碎清洗后的新生仔豬肝組織轉移到50mL無菌離心管中，加入10mL消化液，用封口膜封住離心管，在37℃條件下恒溫振蕩孵育器中以200rpm的轉速進行孵育消化；其中，消化液包括無血清DMEM/F-12培養基和2.5mg/mL膠原酶D；

步驟2，1小時后，取25μL消化后的溶液在蓋玻片上，顯微鏡拍照并用標尺測量類器官細小顆粒的大小，當大部分顆粒的直徑在100-200μM范圍內停止消化；若大于200μM，則每15分鐘檢測一次；類器官細小顆粒為單細胞群，其保留了細胞間的基質；

步驟3，完成消化后，將50mL離心管在室溫下以530g的轉速離心5分鐘，小心去除上清，加入5mL紅細胞去除液去除紅細胞，重懸類器官細小顆粒，37℃孵育5分鐘，在室溫以530g的轉速離心5分鐘，小心去除上清，再加入10mL基礎培養基重懸，取25μL在顯微鏡下計數，在室溫下以530g的轉速離心5分鐘；

步驟4，將步驟3得到的類器官顆粒在預冷的PBS中重懸，密度調整為4×10⁴，與基質凝膠按1:1混合，以每孔1000個的密度接種在24孔板中，小心放入37℃培養箱；

步驟5，當基質凝膠凝固后，在每個孔內加入500μL誘導培養基，孵育4天，維持類器官正常生長，從第5天開始，換用擴張培養基培養，擴張培養基每3-4天更換一次，得到豬肝臟組織類器官模型。

2.根據權利要求1所述的一種豬肝臟組織類器官模型的體外構建方法，其特征在于，所述誘導培養基，包括：B27細胞培養添加劑、N2細胞培養添加劑、N-乙酰半胱氨酸、Rspo1條件培養基、煙酰胺、重組人[Leu15]-胃泌素I、重組人EGF、重組人FGF10、重組人HGF、Forskolin、A83-01、重組人Noggin或Noggin條件培養基、Wnt3a條件培養基和Rho激酶抑制劑，其中B27細胞培養添加劑不含維生素A。

3.根據權利要求1所述的一種豬肝臟組織類器官模型的體外構建方法，其特征在于，所述誘導培養基，包括：1:50B27細胞培養添加劑、1:100N2細胞培養添加劑、1mM N-乙酰半胱氨酸、10％(vol/vol)Rspo1條件培養基、10mM煙酰胺、10nM重組人[Leu15]-胃泌素I、50ng/ml重組人EGF、100ng/ml重組人FGF10、25ng/ml重組人HGF、10μM Forskolin、5μM A83-01、25ng/ml重組人Noggin或5％(vol/vol)Noggin條件培養基、30％(vol/vol)Wnt3a條件培養基和10μM Rho激酶抑制劑，其中，B27細胞培養添加劑不含維生素A。

4.根據權利要求1所述的一種豬肝臟組織類器官模型的體外構建方法，其特征在于，所述擴張培養基，包括：B27細胞培養添加劑、N2細胞培養添加劑，N-乙酰半胱氨酸、Rspo1條件培養基、煙酰胺、重組人[Leu15]-胃泌素I、重組人EGF、重組人FGF10、重組人HGF、Forskolin和A83-01，其中B27細胞培養添加劑不含維生素A。

5.根據權利要求1所述的一種豬肝臟組織類器官模型的體外構建方法，其特征在于，所述擴張培養基，包括：1:50B27細胞培養添加劑、1:100N2細胞培養添加劑、1mM N-乙酰半胱氨酸、10％(vol/vol)Rspo1條件培養基、10mM煙酰胺、10nM重組人[Leu15]-胃泌素I、50ng/ml重組人EGF、100ng/ml重組人FGF10、25ng/ml重組人HGF、10μM Forskolin和5μM A83-01，其中B27細胞培養添加劑不含維生素A。

6.根據權利要求1所述的一種豬肝臟組織類器官模型的體外構建方法，其特征在于，新生仔豬肝組織的剪碎清洗步驟，包括：

將采集的新生仔豬的肝組織用含有5倍青霉素、鏈霉素、慶大霉素和兩性霉素B的PBS清洗液反復沖洗后剪碎，再用含有5倍青霉素、鏈霉素、慶大霉素和兩性霉素B的PBS清洗液進行離心清洗直至上清液清澈。

7.一種由權利要求1至6任一項所述方法構建的豬肝臟組織類器官模型。