[發明專利]一種豬肝臟組織類器官模型及其體外構建方法

有效

• 申請號: 202010854860.7
• 申請日: 2020-08-24
• 公開（公告）號: CN111979179B
• 公開（公告）日: 2022-12-27
• 發明（設計）人: 蔡德敏;劉好雨;李豪;辛子蒙;張可欣;顧昊天;李艷偉
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 王麗霞

本發明公開一種豬肝臟組織類器官模型的體外構建方法。將新生仔豬的肝組織剪碎清洗后，加入消化液進行孵育消化，得到類器官細小顆粒；將類器官細小顆粒與基質凝膠混合后進行接種；待基質凝膠凝固后，先用誘導培養基孵育4天，然后換用擴張培養基培養，擴張培養基每3?4天更換一次，得到豬肝臟組織類器官模型。本發明構建方法簡單，構建迅速，可操作性強，直接通過新生動物類器官小顆粒構建類器官模型，不僅能夠真實反映豬活體模型中的內環境，還能用于在分子細胞水平研究豬在體模型中肝臟的生長以及脂質代謝，減少對活體豬的采樣。

技術領域

本發明屬于動物細胞工程技術領域，涉及一種豬肝臟組織類器官模型的體外構建方法。

背景技術

類器官（Organoids）是一種通過3D培養技術在體外構建的微器官。因其擁有真實器官的復雜三維結構以及與來源器官高度相似的生理功能，從而在生物學領域得到了廣泛的應用，并逐步代替細胞系。使用細胞外基質（如基質凝膠）的獨特系統使有機物更接近體內組織結構和功能特性的肝臟類器官培養正在成為原代細胞培養的一種流行的替代方法，用于在培養皿中重現組織和研究人體和小鼠的肝臟生理學和疾病發病機制。然而，這種方法雖然可以消除體外較多干擾效應，并提供體內組織的簡化模型，但在大型動物中還沒有很好的建立。并且，目前人源或者鼠源肝臟類器官的構建還是以肝臟單細胞構建為主，通過干細胞誘導成類器官，其存在的缺點是缺少細胞間的基質，不能完全真實地模擬體內肝臟的生理學功能。

發明內容

本發明的目的在于提供一種豬肝臟組織類器官模型的體外構建方法，以解決現有技術中存在的目前人源或鼠源肝臟類器官構建以肝臟單細胞構建為主，得到的類器官缺少細胞間的基質，不能真實地模擬體內肝臟生理學功能的問題。

為達到上述目的，本發明采用以下技術方案：

一種豬肝臟組織類器官模型的體外構建方法，包括以下步驟：

將新生仔豬的肝組織剪碎清洗后，加入消化液進行孵育消化，得到類器官細小顆粒；

將類器官細小顆粒與基質凝膠混合后進行接種；

待基質凝膠凝固后，先用誘導培養基孵育4天，然后換用擴張培養基培養，擴張培養基每3-4天更換一次，得到豬肝臟組織類器官模型。

進一步地，所述消化液，包括：無血清DMEM/F-12培養基和膠原酶D。

進一步地，所述誘導培養基，包括：B27細胞培養添加劑、N2細胞培養添加劑、N-乙酰半胱氨酸、Rspo1條件培養基、煙酰胺、重組人[Leu15]-胃泌素I、重組人EGF、重組人FGF10、重組人HGF、Forskolin、A83-01、重組人Noggin或Noggin條件培養基、Wnt3a條件培養基和Rho激酶抑制劑，其中B27細胞培養添加劑不含維生素A。

進一步地，所述誘導培養基，包括：1:50 B27細胞培養添加劑、1:100 N2細胞培養添加劑、1 mM N-乙酰半胱氨酸、10%（vol/vol）Rspo1條件培養基、10 mM煙酰胺、10 nM重組人[Leu15]-胃泌素I、50 ng/ml重組人EGF、100 ng/ml重組人FGF10、25 ng/ml重組人HGF、10μM Forskolin、5μM A83-01、25ng/ml重組人Noggin或5%（vol/vol）Noggin條件培養基、30%（vol/vol）Wnt3a條件培養基和10μM Rho激酶抑制劑，其中，B27細胞培養添加劑不含維生素A。

進一步地，所述擴張培養基，包括：B27細胞培養添加劑、N2細胞培養添加劑，N-乙酰半胱氨酸、Rspo1條件培養基、煙酰胺、重組人[Leu15]-胃泌素I、重組人EGF、重組人FGF10、重組人HGF、Forskolin和A83-01，其中B27細胞培養添加劑不含維生素A。