[發(fā)明專(zhuān)利]與西伯利亞杏開(kāi)花期早晚相關(guān)的標(biāo)記及其檢測(cè)引物、方法與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010850322.0
• 申請(qǐng)日: 2020-08-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111826462B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-06-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 烏云塔娜;徐宛玉;王淋;朱高浦;趙罕;陳晨;劉慧敏;黃夢(mèng)真;茍寧寧;王楚;白海坤
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟(jì)林研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6895
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京冠榆知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11666
• 代理人: 朱亞琦

1.與西伯利亞杏開(kāi)花期早晚相關(guān)的檢測(cè)方法，其特征在于，具體包括如下步驟：

（1）提取基因組DNA：以西伯利亞杏材料為檢測(cè)樣品，提取基因組DNA；

（2）進(jìn)行PCR擴(kuò)增：以提取的西伯利亞杏DNA為模板，利用引物對(duì)Primer1-?Primer?6分別進(jìn)行PCR產(chǎn)物擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；

（3）PCR產(chǎn)物回收：使用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物；

（4）進(jìn)行一代測(cè)序，判定西伯利亞杏開(kāi)花期早晚；

在步驟（2）中：

?所述Primer1的正向引物和反向引物的序列分別為SQE?ID?NO:1和SQE?ID?NO:2；

?所述Primer2的正向引物和反向引物的序列分別為SQE?ID?NO:3和SQE?ID?NO:4；

?所述Primer3的正向引物和反向引物的序列分別為SQE?ID?NO:5和SQE?ID?NO:6；

?所述Primer4的正向引物和反向引物的序列分別為SQE?ID?NO:7和SQE?ID?NO:8；

?所述Primer5的正向引物和反向引物的序列分別為SQE?ID?NO:9和SQE?ID?NO:10；

?所述Primer6的正向引物和反向引物的序列分別為SQE?ID?NO:11和SQE?ID?NO:12；

?PCR產(chǎn)物的凝膠電泳圖顯示，獲得含有與西伯利亞杏開(kāi)花期早晚相關(guān)的片段，分別為：

若加入引物為Primer1，則得到長(zhǎng)度為227bp的含Ps-FT-SNP1和Ps-FT-SNP2標(biāo)記的西伯利亞杏F106基因組的6號(hào)染色體的片段18103605-18103831，

若加入引物為Primer2，則得到長(zhǎng)度為158bp的含Ps-FT-SNP3標(biāo)記的西伯利亞杏F106基因組的的6號(hào)染色體的片段18104056-18104213，

若加入引物為Primer3，則得到長(zhǎng)度為198bp的含Ps-FT-SNP4標(biāo)記的西伯利亞杏F106基因組的的6號(hào)染色體的片段18104977-18105174，

若加入引物為Primer4，則得到長(zhǎng)度為219bp的含Ps-FT-SNP5標(biāo)記的西伯利亞杏F106基因組的的6號(hào)染色體的片段18106219-18106437，

若加入引物為Primer5，則得到長(zhǎng)度為240bp的含Ps-FT-SNP6標(biāo)記的西伯利亞杏F106基因組的的6號(hào)染色體的片段18106550-18106789，

若加入引物為Primer6，則得到長(zhǎng)度為387bp的含Ps-FT-SNP7標(biāo)記的西伯利亞杏F106基因組的的6號(hào)染色體的片段18107035-18107421；

在步驟（4）中：

若使用Primer1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，Primer1檢測(cè)得到的PCR產(chǎn)物的序列長(zhǎng)度為227bp，若位于該序列自5’端起的第165位堿基為G，則判定待測(cè)西伯利亞杏的Ps-FT-SNP1位點(diǎn)的基因型為GG；若位于該序列自5’端起的第165位堿基為G或A，則判定待測(cè)西伯利亞杏的Ps-FT-SNP1位點(diǎn)的基因型為GA或AA；

若位于該序列自5’端起的第183位堿基為G，則判定待測(cè)西伯利亞杏的Ps-FT-SNP2位點(diǎn)的基因型為GG；若位于該序列自5’端起的第183位堿基為G或A，則判定待測(cè)西伯利亞杏的Ps-FT-SNP2位點(diǎn)的基因型為GA或AA；所述長(zhǎng)度為227bp的序列為：?TTTCACCGTACAAGCTCTGCCTGGGCGCCATGTGTCGACATCTGATACTTGTCTCTGGGAAAAGGCTAGACTATGCTAGTTGATGATGAATAAAAAAGGGATGCTTGGGCACACGAGTGGTGTCTGGGGTGGAACACAACATCGTGCGTGGCTATTGTCCCTATnGGAGACACACAGGCCAGnGCCTATGTGTTTCTCCATCGGACACGTCGGTTCTGATGCCATTT，其中n為G或A；

若使用Primer2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，Primer2檢測(cè)得到的PCR產(chǎn)物的序列長(zhǎng)度為158bp，若位于該序列自5’端起的第85位堿基為T(mén)，則判定待測(cè)西伯利亞杏的Ps-FT-SNP3位點(diǎn)的基因型為T(mén)T；若位于該序列自5’端起的第85位堿基為T(mén)或A，則判定待測(cè)西伯利亞杏的Ps-FT-SNP3位點(diǎn)的基因型為T(mén)A或AA；所述長(zhǎng)度為158bp的序列為：?AACAGACATGCATGCAGACATTGTTAAGAAAGAAAGACAATAAAAGCATAGATTTAGGCGAAGAACACGGAATCACTTTTGGATnGAGAAAAGGGTTTCTTTATACTTGGATTTTTGTTCTGTTTCAGAGCATCTCTAACTCCAAAATCCTGCTGCAG，其中n為T(mén)或A；

若使用Primer3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，Primer3檢測(cè)得到的PCR產(chǎn)物的序列長(zhǎng)度為198bp，若位于該序列自5’端起的第74位堿基為T(mén)，則判定待測(cè)西伯利亞杏的Ps-FT-SNP4位點(diǎn)的基因型為T(mén)T；若位于該序列自5’端起的第74位堿基為T(mén)或G，則判定待測(cè)西伯利亞杏的Ps-FT-SNP4位點(diǎn)的基因型為T(mén)G或GG；所述長(zhǎng)度為198bp的序列為：?CGCACACTCTCTCCAAAACACAAAACAATGGGAGAAATCTGAAAACTGGTTAAGCATTCCATGGTATGTGTTTnAAAAAACTTAAAGTATTGAGAGAGCAATTGACTATAAGACATTAATTCAGCCCCCATTTTGGTGTTTTAGTGAAACTCCCTTATTTTCTTGGGTTATTTTCTTGACCGTAGGGACTAATGGTGC，其中n為T(mén)或G；

若使用Primer4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，Primer4檢測(cè)得到的PCR產(chǎn)物的序列長(zhǎng)度為219bp，若位于該序列自5’端起的第151位堿基為G，則判定待測(cè)西伯利亞杏的Ps-FT-SNP5位點(diǎn)的基因型為GG；若位于該序列自5’端起的第151位堿基為G或A，則判定待測(cè)西伯利亞杏的Ps-FT-SNP5位點(diǎn)的基因型為GA或AA；所述長(zhǎng)度為219bp的序列為：?GTGTTGGTGGTGTAGGCTTGGAGTTTACTGGTGGTTGGCTTCTACGAGTTCTTGGCTTAAATGGATATGTTGCTTTCTAGGACCCTTGGTGTTGGGCATGATTTTCAATGGATAGGGTTGTTGGTTGCAATCTATGTTCCCATCTCTCCAnGTAATTTTGTGGTGGGGATTTGACATTTAGGTGGTGTTAGAGCCTTCGGGCAACACTCTGACCTCTCA；其中n為G或A；

若使用Primer5進(jìn)行PCR擴(kuò)增，Primer5檢測(cè)得到的PCR產(chǎn)物的序列長(zhǎng)度為240bp，若位于該序列自5’端起的第89位堿基為T(mén)，則判定待測(cè)西伯利亞杏的Ps-FT-SNP6位點(diǎn)的基因型為T(mén)T；若位于該序列自5’端起的第89位堿基為T(mén)或C，則判定待測(cè)西伯利亞杏的Ps-FT-SNP6位點(diǎn)的基因型為T(mén)C或CC；所述長(zhǎng)度為240pb的序列為：?GGCTTGGCATCCGATACATGTTCATACTATGATGCCCTTCCATTAGAAGTTCGTCACGCTAAGAGGCCAATATGGATCCCCCATGGCCnGTCGAGTAAGGGTCTAGATTAAGATTCATGGAGTTGGTATTGGTACTTATGCTGGATATGCTTTGACACTCATAACACATTGTTATGTACATCGAACTATCCATGCATAGGAGTTTTTCTTTGACAGTCTTACGTTGTGGTGGGTTGTTT；其中n為T(mén)或C；

若使用Primer6進(jìn)行PCR擴(kuò)增，Primer6檢測(cè)得到的PCR產(chǎn)物的序列長(zhǎng)度為387bp，若位于該序列自5’端起的第185位堿基為C，則判定待測(cè)西伯利亞杏的Ps-FT-SNP7位點(diǎn)的基因型為CC；若位于該序列自5’端起的第185位堿基為C或T，則判定待測(cè)西伯利亞杏的Ps-FT-SNP7位點(diǎn)的基因型為CT或TT；所述長(zhǎng)度為387bp的序列為：?CCAAATTGGCATGTGTCGGACTCTCTTGTTAGTCCAAGACATGTGTTGTATTCTTTCCTACCATGGGGTTTGTCCCATGTGATTTTCCTATAAAGGTTTTAATAAGGCCGTTGTTTCGTGCCCGTCTTTGTATGTCTCTTTGGATTATGAATGAAATCCTTTTCTAAAACTATCATTGACATTAnGTGCCCATTAAAACTATCAATTACTTTAGCCTTTCTAGTATAAAGAGTAGCTCAAAATATGCACTTGTAGTCATTTTAATATTATTAATGAGTAATGGAAAAGACAAATCAGCAATTAGTCTAATGTTACTTCTCTTCTTAACATTCCGTATCCTATTGGCAAACATAAGTTATAAGCTTAATCCCGAATCGCATGTCTTTG；其中n為C或T；

將步驟（4）得到的測(cè)序結(jié)果，與參考序列進(jìn)行比對(duì)，判定西伯利亞杏的花期：

若Ps-FT-SNP1的基因型為GG，Ps-FT-SNP2基因型為GG，Ps-FT-SNP3的基因型為T(mén)T，Ps-FT-SNP4基因型為T(mén)T，Ps-FT-SNP5基因型為GG，Ps-FT-SNP6基因型為T(mén)T，Ps-FT-SNP7基因型為CC，則判定待測(cè)西伯利亞杏為早花；

若Ps-FT-SNP1的基因型為GA或AA，則判定待測(cè)西伯利亞杏為晚花；

若Ps-FT-SNP2基因型為GA或AA，則判定待測(cè)西伯利亞杏為晚花；

若Ps-FT-SNP3的基因型為T(mén)A或AA，則判定待測(cè)西伯利亞杏為晚花；

若Ps-FT-SNP4基因型為T(mén)G或GG，則判定待測(cè)西伯利亞杏為晚花；

若Ps-FT-SNP5基因型為GA或AA，則判定待測(cè)西伯利亞杏為晚花；

若Ps-FT-SNP6基因型為T(mén)C或CC，則判定待測(cè)西伯利亞杏為晚花；

若Ps-FT-SNP7基因型為CT或TT，則判定待測(cè)西伯利亞杏為晚花；

所述西伯利亞杏樣品為萬(wàn)家溝15、巴林右旗24、科右45、科左33、克什克騰22、萬(wàn)家溝17、山杏3號(hào)、科左38、扎魯特08、烏拉山08或克什克騰05。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的與西伯利亞杏開(kāi)花期早晚相關(guān)檢測(cè)方法，其特征在于，在步驟（2）中：

反應(yīng)體系為25μL，包括：

12.5μL的2×Taq?PCR?Mix，

0.5μl的待檢測(cè)DNA，

0.5μL的正向引物，濃度為10μmol/L；0.5μl的反向引物，濃度10μmol/L，

11μL的DNase/RNase-Free?water；

反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性45s；55℃退火45s；72℃延伸60s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃總延伸6min；最后于4℃保存。