[發明專利]一種快速檢測草莓膠孢炭疽菌的PCR引物及定量檢測方法

在審

• 申請號: 202010848341.X
• 申請日: 2020-08-21
• 公開（公告）號: CN111893208A
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發明（設計）人: 楊靜;高清華;段可
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6851;C12Q1/686;C12Q1/06;C12N15/11
• 代理公司: 上海開祺知識產權代理有限公司 31114
• 代理人: 張曉敏;費開逵

一種快速檢測草莓膠孢炭疽菌的PCR引物及定量檢測方法，根據膠孢炭疽菌生理小種的cutinase基因共有序列設計，包括兩條引物Cfcut1和Cfcut2，擴增產物115bp；利用本發明，無需經過病原菌的分離、培養，可以對真菌基因組DNA或田間樣本DNA進行PCR檢測，擴增效率高，特異性好，引物的擴增效率為99.47％，快速檢測、鑒定引起草莓炭疽病的膠孢炭疽菌復合種；通過實時熒光定量PCR，可對樣本中的膠孢炭疽菌生物量進行絕對定量檢測，及時、準確預測炭疽病的發生時期、流行強度，提早防治甚至避免炭疽病的發生，可以降低因農藥使用所帶來的負面影響，為炭疽病的綜合防治提供依據。

技術領域

本發明屬于植物病菌檢測領域，具體涉及一種快速檢測草莓膠孢炭疽菌的PCR引物及定量檢測方法。

背景技術

草莓屬于薔薇科，草莓屬，多年生草本植物，為我國傳統的優秀果品之一，草莓作為目前上海地區園藝作物中的特色優勢產業，經濟效益十分顯著，市郊面積常年維持在4萬畝左右。然而，草莓病害一直制約草莓產業的發展，草莓炭疽病作為草莓生產上的主要病害之一，近年來的發生危害有上升趨勢。

“草莓炭疽病”指所有炭疽菌屬真菌引起的草莓病害，己報道的草莓炭疽病病原菌主要有膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)和尖孢炭疽菌(Colletotrichumacutatum)兩種，在我國，草莓炭疽病報道最多的是膠孢炭疽菌復合種。在我國草莓生產中，草莓炭疽病危害嚴重的年份直接導致減產50～80％，甚至絕產。因此，草莓炭疽病在上海乃至世界各地的草莓主產區一直是制約草莓產業持續穩定發展的主要瓶頸。

采用無病種苗可以避免草莓炭疽病的發生。育苗基地多選在無草莓炭疽病發生的地方，但隨著草莓種植規模的擴大，病害的傳播范圍越來越廣，這種方法實施的難度越來越大。因此，種苗檢疫在草莓種植過程中是必不可少的，但是，由于草莓炭疽菌具有潛伏侵染的特征，帶菌的種苗并不表現癥狀，這就給檢測帶來了難度。

傳統的炭疽菌鑒定方法需要經過病原菌的分離、培養，進一步依據其培養特征和微觀形態結構來進行判斷，耗時耗力；并且，依據標記基因ITS、β-tubulin、ACT、CAL、CHS、GAPDH等的PCR特異性檢測具有信息錯誤率高、無法實現種內關系區分等特點，而基于此的多基因聯合建樹系統進化分析雖然被公認為炭疽菌鑒定的標準操作，但由于其復雜性和消耗時間長，無法應用于田間的快速檢測。

目前該病的最主要防治手段仍是噴施化學農藥，隨著施藥量的增加，出現了如果實品質下降、環境污染、病菌抗性產生等一系列問題。因此，開展草莓炭疽病預測預報研究對于科學防治草莓炭疽病具有重要的意義。

發明內容

本發明的目的在于提供一種快速檢測草莓膠孢炭疽菌的PCR引物及定量檢測方法，能夠快速檢測、鑒定引起我國草莓炭疽病的主要炭疽菌種類膠孢炭疽菌復合種(Colletotrichum gloeosporioides species complex)，無需經過病原菌的分離、培養等步驟，節省時間和成本，并且可通過實時熒光定量PCR的方法對樣本中的膠孢炭疽菌生物量進行絕對定量檢測，快速準確，進一步為作物材料的抗性評價和篩選育種工作提供良好的途徑。

為了實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種快速檢測草莓膠孢炭疽菌的PCR引物，根據膠孢炭疽菌生理小種C.fructicola、C.siamense和C.aenigma對應的35個菌株的cutinase基因共有序列設計，所述共有序列如SEQ ID NO.1所示，包括兩條引物Cfcut1和Cfcut2，擴增產物115bp，引物核苷酸序列如下：

Cfcut1：5’-AGAACCAGATCAAGGGCGTCGTG-3’；

Cfcut2：5’-GCGTCCGCAATGTCGCAGTA-3’。