[發明專利]一種快速檢測草莓膠孢炭疽菌的PCR引物及定量檢測方法

在審

• 申請號: 202010848341.X
• 申請日: 2020-08-21
• 公開（公告）號: CN111893208A
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發明（設計）人: 楊靜;高清華;段可
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6851;C12Q1/686;C12Q1/06;C12N15/11
• 代理公司: 上海開祺知識產權代理有限公司 31114
• 代理人: 張曉敏;費開逵

1.一種快速檢測草莓膠孢炭疽菌的PCR引物，其特征在于，根據膠孢炭疽菌生理小種C.fructicola、C.siamense和C.aenigma對應的多個菌株的cutinase基因共有序列設計引物，包括兩條引物Cfcut1和Cfcut2，擴增產物115bp，所述共有序列如SEQ ID NO.1所示，引物核苷酸序列如下：

Cfcut1：5’-AGAACCAGATCAAGGGCGTCGTG-3’；

Cfcut2：5’-GCGTCCGCAATGTCGCAGTA-3’。

2.一種快速檢測草莓膠孢炭疽菌的PCR試劑盒，其包括權利要求1所述的兩條引物Cfcut1和Cfcut2，終濃度各為200～300nM。

3.一種草莓膠孢炭疽菌的PCR快速檢測方法，以樣品DNA為模板，利用權利要求1所述引物Cfcut1和Cfcut2進行PCR擴增，退火溫度為60℃，反應結束后通過瓊脂糖凝膠檢測擴增產物，根據產物片段大小判斷膠孢炭疽菌的有無，若存在115bp的擴增產物條帶，則樣品中含有膠孢炭疽菌。

4.根據權利要求3所述草莓膠孢炭疽菌的PCR快速檢測方法，其特征在于，所述樣品DNA為真菌基因組DNA或草莓樣本基因組DNA。

5.一種對草莓膠孢炭疽菌生物量進行絕對定量的快速檢測方法，包括以下步驟：

1)以10倍等濃度梯度稀釋的膠孢炭疽菌標準品質粒系列為模板，利用引物Cfcut1和Cfcut2進行實時熒光定量PCR擴增，獲得對應標準品的循環數Cq值，利用獲得的循環數Cq值和相應的質粒模板拷貝數作圖，獲得標準曲線方程；

2)以草莓樣品基因組DNA為模板，利用引物Cfcut1和Cfcut2進行實時熒光定量PCR擴增，95℃2分鐘；95℃15秒，60℃10秒，40個循環；反應結束后，獲得樣品的循環數Cq值，代入標準曲線方程，計算出樣品中的膠孢炭疽菌的起始拷貝數。

6.根據權利要求5所述對草莓膠孢炭疽菌生物量進行絕對定量的方法，其特征在于，所述標準曲線方程為Y＝-3.3348(log₁₀X)+34.726，Y為循環數Cq值，X為起始拷貝數，相關系數R²值0.9992。

7.根據權利要求5所述對草莓膠孢炭疽菌生物量進行絕對定量的方法，其特征在于，所述實時熒光定量PCR擴增中，引物Cfcut1和Cfcut2的擴增效率為99.47％。

8.根據權利要求5所述對草莓膠孢炭疽菌生物量進行絕對定量的方法，其特征在于，所述實時熒光定量PCR擴增程序采用兩步法，退火溫度為60℃，擴增體系中引物濃度各為100nM。

9.如權利要求1所述快速檢測草莓膠孢炭疽菌的PCR引物在草莓炭疽菌檢測中的應用。