[發明專利]MDCK細胞系的懸浮培養馴化方法

有效

• 申請號: 202010848242.1
• 申請日: 2020-08-21
• 公開（公告）號: CN111944741B
• 公開（公告）日: 2023-03-14
• 發明（設計）人: 朱紹榮;張成林
• 申請（專利權）人: 上海榮盛生物藥業股份有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N1/36
• 代理公司: 泰和泰律師事務所 51219
• 代理人: 魏渲輝

一種MDCK細胞系的懸浮培養馴化方法，先用含血清培養基貼壁培養MDCK細胞，再經消化后，將所得細胞懸液置入搖瓶懸浮培養，傳代3～4次后，將培養液離心，并使用化學限定培養基重懸細胞團，繼續懸浮培養，傳代至MDCK細胞完全單個懸浮生長。本發明的馴化方法，相較于逐步降血清法更快速高效，馴化時間僅需10代左右，遠高于逐步降血清方法。相較于一步馴化法更溫和，不受馴化所用無血清培養基的品質限制，更具有普遍應用價值，且其所用馴化時間同樣較短，與一步馴化法相當。

技術領域

本發明涉及一種用于生產生物制品的方法，尤其涉及一種馴化細胞的方法，以使其是適應懸浮培養。

背景技術

近年來，全球季節性流感疫苗的市場需求正在逐年穩步上升，眾多發展中國家疫苗接種率較低的事實更是體現了季節性流感疫苗的巨大潛在市場開發前景。此外自2009年后歲無大流行流感的爆發，流感病毒依然對人類社會存在威脅。相較于傳統的雞胚生產法，用動物細胞來生產流感疫苗正在逐步成為主流生產方式。在過去十幾年中，使用貼壁MDCK細胞來擴增流感病毒已取得了巨大的進展，然而該培養模式仍存在諸多的弊端，如：血清的使用會因換液導致培養工藝的復雜性以及血清批次引起的工藝穩定性問題。此外，高細胞密度培養通常受到微載體的表面積的限制，而MDCK細胞的在無血清或化學限定培養基中懸浮培養則可以解決以上弊端，使生產工藝操作簡單、控制穩定、簡化下游純化操作，更易實現流感疫苗的大規模生產。在化學限定培養基中培養MDCK細胞因培養基成分明確、外源DNA含量控制而更適宜用于人用流感疫苗的生產。

獲得可懸浮培養的MDCK細胞系需要進行MDCK貼壁細胞的馴化。目前常用的方法為逐步降血清法和一步馴化法。CN109929796A公開了一種通過逐步降血清法即降血清適應培養和懸浮培養馴化兩個步驟獲得的適應于無血清培養的懸浮MDCK細胞，馴化周期為35周。諸多案例均表明了逐步降血清法細胞馴化時間長、步驟繁瑣、多出現細胞結團現象等缺陷，無法支持高密度生長。CN107460156A公開了一種通過一步馴化法獲得的適應于無血清懸浮培養的MDCK細胞，但該方法通常存在較大偶然性，對馴化使用的培養基以及馴化培養條件有著較高的要求，設計合理的培養基和優化的培養條件才能夠支持快速的馴化，但獲得的細胞密度尚不能滿足規模化生產的要求。

發明內容

本發明的一個目的在于提供一種MDCK細胞系的懸浮培養馴化方法，將貼壁細胞馴化為單個懸浮細胞，實現細胞的懸浮培養。

本發明的另一個目的在于提供一種MDCK細胞系的懸浮培養馴化方法，提高并獲得穩定的細胞的比生長速率。

本發明的再一個目的在于提供一種MDCK細胞系的懸浮培養馴化方法，提高細胞活率。

本發明的又一個目的在于提供一種MDCK細胞系的懸浮培養馴化方法，增強對流感病毒H1N1和H3N2的擴增能力，獲得的病毒滴度高。

本發明所稱的“MDCK”、MDCK細胞或“MDCK細胞系”具有相同的含義，包括來自自然界的野生型MDCK，也包括通過人工手段將自然界中的MDCK細胞中進行改造。比如：通過改造了細胞干擾素抗病毒應答能力，因此使得MDCK細胞系具有更高的病毒擴增能力。通過馴化得到的新型細胞系同樣保留了高產特性，還對H1N1和H3N2流感病毒均有優秀的擴增能力，適用于大規模的流感疫苗生產中。

一種MDCK細胞系的懸浮培養馴化方法，包括如下步驟：

先將于含血清培養基中培養的MDCK貼壁細胞培養至細胞匯合度為80％～90％時，棄去含血清培養基，潤洗(如：磷酸緩沖鹽溶液，PBS)后加入胰酶溶液消化5分鐘～10分鐘；待細胞變圓后，輕輕拍打容器底部使MDCK細胞解離，加入含血清培養基終止消化；

接著將收集到的MDCK細胞懸液轉移至搖瓶中，加入含血清培養基并將細胞密度調整至0.8～1.5×10⁶個細胞/mL，懸浮培養，將搖床轉速設定為100rpm，溫度設定為37℃，CO₂濃度設定為5％；