[發明專利]MDCK細胞系的懸浮培養馴化方法

有效

• 申請號: 202010848242.1
• 申請日: 2020-08-21
• 公開（公告）號: CN111944741B
• 公開（公告）日: 2023-03-14
• 發明（設計）人: 朱紹榮;張成林
• 申請（專利權）人: 上海榮盛生物藥業股份有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N1/36
• 代理公司: 泰和泰律師事務所 51219
• 代理人: 魏渲輝

1.一種MDCK細胞系的懸浮培養馴化方法，包括如下步驟：

先將于添加10%胎牛血清的DMEM培養基中培養的MDCK貼壁細胞培養至細胞匯合度為80%~90%時，棄去添加10%胎牛血清的DMEM培養基，潤洗后加入胰酶溶液消化5分鐘~10分鐘；待細胞變圓后，輕輕拍打容器底部使MDCK細胞解離，加入添加10%胎牛血清的DMEM培養基1-2 mL終止消化；

接著將收集到的MDCK細胞懸液轉移至搖瓶中，加入添加10%胎牛血清的DMEM培養基并將細胞密度調整至0.8~1.5×10⁶個細胞/mL，懸浮培養，將搖床轉速設定為100rpm，溫度設定為37℃，CO₂濃度設定為5%；

然后，用添加10%胎牛血清的DMEM培養基對MDCK細胞進行3~4次傳代，每隔48小時傳代一次，每次傳代后細胞密度需保持在0.8~1.5×10⁶個細胞/mL；

之后，將含MDCK細胞的培養液以1000rpm離心10分鐘并棄上清液，加入化學限定培養基重懸細胞團，繼續懸浮培養，并傳代至少6代至MDCK細胞完全單個懸浮生長，獲得在化學限定培養基中懸浮培養的MDCK細胞系，搖床轉速設定為130rpm，溫度設定為37℃，CO₂濃度設定為5%，所述化學限定培養基的各組分及其含量為：

基礎代謝營養物為：

5000mg/L D-葡萄糖、200mg/L丙酮酸鈉、15～17mg/L L-丙氨酸、285～295mg/L L-精氨酸 、35～40mg/L L-天冬酰胺、35～40mg/L L-天冬氨酸、45～50mg/L L-胱氨酸、75～80mg/L L-半胱氨酸、30～35mg/L L-谷氨酸、840～860mg/L L-谷氨酰胺、45～55mg/L甘氨酸、70～80mg/L L-組氨酸；80～90mg/L L-異亮氨酸、130～140mg/L L-亮氨酸、100～110mg/L L-賴氨酸、80～90mg/L L-甲硫氨酸、100～110mg/L L-苯丙氨酸、90～100mg/L L-脯氨酸、70～80mg/L L-絲氨酸、120～130mg/L L-蘇氨酸、50～60mg/L L-色氨酸、55～65mg/L L-酪氨酸和90～100mg/L L-纈氨酸；

核苷酸為：

10～15mg/L次黃嘌呤、0.3～0.6mg/L胸苷、6～9mg/L腺苷、6～9mg/L尿苷、6～9mg/L胞苷和6～9mg/L鳥苷；

維生素為：

0.05～0.10mg/L D-生物素、4～8mg/L葉酸、4～8mg/L煙酰胺、4～8mg/L吡哆醇、3～5mg/L硫胺素、0.4～0.6mg/L核黃素、30～40mg/L氯化膽堿、5～8mg/L D-泛酸鈣和30～35mg/L肌醇；

無機鹽為：

20～30mg/L硝酸鐵、0.3～0.6mg/L硫酸亞鐵、30～50mg/L硫酸鎂、320～330mg/L氯化鉀、6500～7500mg/L氯化鈉、65～75mg/L磷酸氫二鈉、60～70mg/L磷酸二氫鈉和50～60mg/L亞硒酸鈉；

1500～2000mg/L Pluronic F-68、50～70mg/L硫酸葡聚糖；

流感病毒增殖促進劑為：

3～5mg/L膽固醇、1.0～2.0mg/L DL-α-生育酚醋酸酯、0.1～0.3mg/L豆蔻酸、0.3～0.4mg/L棕櫚酸、0.2～0.4mg/L硬脂酸、3000～3300mg/L氯化鎂、170～180mg/L氯化鈣、10～15mg/L二甲基亞砜、1.0～1.3mg/L硫酸鋅、15～20mg/L硫酸銅、0.0003～0.0005mg/L硫酸錳和0.001～0.003mg/L偏釩酸銨；

其它添加物為：

20～30mg/L檸檬酸鐵銨、3.0～5.0mg/L乙醇胺和1.0～2.0mg/L谷胱甘肽。