[發明專利]一種基于陽離子共軛聚合物和核酸酶輔助循環擴增的檢測目的核酸的方法

有效

• 申請號: 202010842154.0
• 申請日: 2020-08-20
• 公開（公告）號: CN111850103B
• 公開（公告）日: 2022-12-02
• 發明（設計）人: 譚英;陳俊粵;譚春燕;金天
• 申請（專利權）人: 清華大學深圳國際研究生院
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12Q1/6851;C12Q1/6876
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 閆書寧

本發明公開了一種基于陽離子共軛聚合物和核酸酶輔助循環擴增的檢測目的核酸的方法。該方法包括如下步驟：取含有核酸、反應緩沖液、DNA探針和核酸酶的反應體系，孵育；加入azo?PPE(+)，靜置5min以上；檢測熒光強度；根據熒光強度判斷核酸中是否含有目的核酸或目的核酸的含量；DNA探針與目的核酸的核苷酸序列相同或反向互補；DNA探針的末端進行熒光標記；核酸酶用于消化DNA探針和目的核酸形成的雙鏈核酸分子的一條核酸鏈，從而釋放另一條核酸鏈。實驗證明，本發明提供導的方法可以同時檢測多種目的核酸，且準確率高、靈敏度高且特異性好。本發明具有重要的應用價值。

技術領域

本發明屬于生物醫學領域，具體涉及一種基于陽離子共軛聚合物和核酸酶輔助循環擴增的檢測目的核酸的方法。

背景技術

癌癥的存活率往往很低，很可能是由于診斷滯后以及治療手段的缺乏。對癌癥進行早期精確診斷無疑對于癌癥臨床確診、癌癥的分期判斷以及癌癥治療效用評估至關重要。癌癥生物標志物的檢測給癌癥的早期診斷帶來了很大希望，已經成為了研究熱點。癌癥生物標志物存在于腫瘤組織或血清中，并涵蓋多種分子，包括DNA、miRNA、酶、代謝產物、轉錄因子和細胞表面受體等。

腫瘤細胞存在于人類循環系統中，因此細胞內的DNA因為釋放也同樣會存在于循環系統中。與健康人相比，癌癥患者的循環血漿中腫瘤相關DNA含量更高。循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)是一種常見的重要腫瘤標志物，依據對其的檢測可以實現以無創方式對腫瘤進行診斷與分期監測。

miRNA是轉錄后調節基因表達的短的非編碼RNA。miRNA參與癌變過程是通過攜帶抑癌基因和翻譯抑癌基因來實現的。研究證明，miRNA表達含量的異常往往與癌癥的發病、癌細胞的侵襲、病灶的轉移等有關。近些年的研究表明癌癥患者的血漿或者其它的體液中miRNA表達水平通常與癌癥診斷分期、治療評估和病患存活率息息相關。不同類型和子集的腫瘤中miRNA的畸變和獨特表達譜，以及它們在生物體液中的存在，使得miRNA成為可靠的腫瘤生物標記物。

核酸的定量檢測，特別是miRNA含量的定量檢測對于相關生物基礎研究以及癌癥的早期診斷和治療意義重大。然而，miRNA的獨特特征，例如序列短、組織和細胞中含量低以及miRNA家族成員的序列相似性給檢測造成了許多困難。此外，一種癌癥的發生通常與多個miRNA表達水平的變化密切相關，但是在同一體系內實現多個miRNA的檢測一直是miRNA檢測領域的一大難題。

發明內容

現有的檢測目的核酸(DNA或miRNA)的方法靈敏度低、特異性差、設備依賴性高、耗時長、操作復雜，而且難以在同一體系中實現對多個目的核酸的檢測。本發明所要解決的技術問題是提供一種可以在同一體系中同時檢測多個目的核酸的方法。

本發明首先保護一種檢測目的核酸的方法，可包括如下步驟：

(1)取含有核酸、反應緩沖液、DNA探針和核酸酶的反應體系，孵育；

(2)完成步驟(1)后，加入azo-PPE(+)，靜置5min以上(如5min)；

(3)完成步驟(2)后，檢測熒光強度；

根據熒光強度判斷核酸中是否含有目的核酸或目的核酸的含量；

所述DNA探針與目的核酸的核苷酸序列相同或反向互補；

所述DNA探針的末端進行熒光標記；

所述核酸酶用于消化DNA探針和目的核酸形成的雙鏈核酸分子的一條核酸鏈，從而釋放另一條核酸鏈。

所述步驟(1)中，核酸可含有目的核酸。所述核酸具體可為細胞的核酸。

所述步驟(3)中，熒光強度可采用酶標儀測定。